耿 仙 冯承保 吴建民 杨会茹 宋新梅

（1 河北大学医学部药理教研室，保定071002；2 河北省保定市第二医院肿瘤科，保定071000；3 河北省新乐市医院外科，新乐050700；4 河北省新乐市医院儿科，新乐050700）

DNA重组标记技术的成功是因为标记并不改变被标记蛋白的功能，特别有两大进展使得标记技术切实可行：通过合成寡核苷酸和PCR技术将标记物插入到蛋白表达载体中；在病毒、细菌、植物、酵母、昆虫和哺乳动物细胞系统中可表达重组标记蛋白。FLAG标记物是唯一专为标记目的设计的多肽标记物[1]，其特点是标记物的序列不是来自任何已知的蛋白。该标记物是由8个氨基酸残基组成的多肽，具有亲水性，可置于蛋白的氨基或羧基末端。多种FLAG标记蛋白可保留全部的生化活性（如转录因子、生长因子和酶），这些标记物亦广泛应用于细胞染色、免疫印迹和免疫沉淀试验中。本实验采用聚合酶链式反应技术，将 FLAG标记物插入到GIRK4通道的氨基端，通过与蛋白表达载体的连接，表达于爪蟾卵母细胞，使之转录翻译出带有抗原表位标记的GIRK4通道蛋白，为接下来的免疫印迹、免疫沉淀试验做好充分准备。

1 材料与方法

1.1 材料 试剂：GIRK4的cDNA由美国纽约大学西奈山医学院Diomedes Logothetis教授惠赠。

1.2 实验动物 实验选用非洲爪蟾（Xenopus laevis）购自中科院上海神经科学研究所。

1.3 方法

1.3.1 构建重组质粒DNA 设计引物。将FLAG标记短肽的氨基酸序列所对应的 DNA碱基序列插入到GIRK4-pGEMHE的DNA碱基序列的上游，设计好的引物如下：

上游：5’TCT CCC GGG ATG GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG ATG GCT GGC GAT TCT 3’下游：5’CGG AAT TCT CAC ACC GAG CCC C 3’

进行聚合酶链式反应，扩增FLAG-GIRK4 DNA片段，并将其连接至载体pGEMHE质粒DNA中，经过单克隆鉴定、测序，挑取无碱基突变的克隆，重组质粒DNA构建成功。……