孙立新

（天津市乳品食品监测中心，天津 300381）

四环素类抗生素具有广谱的抗菌作用，经常用于预防和治疗奶牛的乳腺炎、子宫炎[1]。但是有研究证明，四环素类抗生素可通过奶的摄入进入人体，导致人的毒副作用及过敏反映[2]。为了保护人类健康，世界卫生组织（WHO）、美国食品药品监督管理局（FDA）以及欧共体（EU）等都限定了奶中四环素类抗生素的残留量，如土霉素的最大残留量为0.1μg/mL，以切实保证人类的食品安全[3]。

20世纪90年代，四环素类药物残留的分析方法主要有微生物法、薄层色谱法、毛细管电泳法、高效液相色谱法和液谱-质谱联机法[4-6]等，但是这些方法中，或存在检测灵敏度低、或存在检测方法所需仪器设备复杂昂贵等缺陷，难以满足实际检测工作的需要[7-9]。

本研究以当前食品检测普遍采用的高效液相色谱仪为手段，通过建立适当的提取和纯化方法、优化色谱分析方法，以实现乳中三种四环素类抗生素的同时检测分析。

1 材料与方法

实验材料：牛奶样品，采自农场生鲜牛乳。

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪（美国waters公司，600E型），配备996型二极管阵列检测器（PDA），pHs－25酸度计（上海精密科学仪器公司）；紫外分光光度计（UNICAM，）；离心机（上海安亭科学仪器厂）；涡旋振荡器。

C18固相萃取柱（Warian Bond Elut，100 mg/1 mL）。

四环素（tetracycline,TC）、土霉素（oxytetracycline,OTC）、金霉素（chlortetracycline,CTC）由中国药品生物制品检定所提供；甲醇、乙腈（色谱纯）；水为超纯水；柠檬酸、乙二氨四乙酸二钠（Na2EDTA）、磷酸氢二钠（分析纯）。

1.2 色谱条件

色谱柱为Nova-PakC18（美国waters公司，150mm×3.9 mm×4.5μm）。

采用草酸0.01 mol/L（pH=2.0）—乙腈—甲醇三元梯度洗脱，洗脱程序为：100%草酸1 min，5 min内变为草酸∶乙腈∶甲醇＝70∶8∶22，并维持 10 min。

流动相流速为0.8 mL/min，进样量20μL，室温检测，检测波长360 nm。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液的配制

准确称取10 mg TC、OTC、CTC标准品，分别用甲醇定容到100 mL棕色容量瓶中，作为标准贮备液。吸取一定量的标准贮备液用0.01 mol/L的草酸甲醇稀释到适当浓度配制标准工作液。

MCI-Vaine 缓冲液[10]：准确称取Na2HPO428.41 g，用水溶解，定容到1000 mL容量瓶中，简称溶液A。准确称取柠檬酸21.00 g，用水溶解，定容到1000 mL容量瓶中，简称溶液B。取625 mL溶液A和1000 mL溶液B混匀，以酸度计调节pH至4.0+0.1。

MCI-Vaine-Na2EDTA缓冲液：准确称取Na2EDTA 60.49g溶解于1625mL的MCI-Vaine液中，配成0.01mol/L Na2EDTA的MCI-Vaine缓冲液。

0.01 mol/L草酸溶液：准确称取草酸1.26 g，用水溶解并定容于1000 mL容量瓶中。以酸度计调节pH=2.0。

0.01 mol/L草酸甲醇溶液：准确称取草酸1.26 g，用甲醇溶解并定容于1000 mL容量瓶中。

1.3.2 样品处理

准确量取2 mL巴氏消毒奶置于离心管中，加入2 mL MCI-Vaine-Na2EDTA缓冲液，在涡旋振荡器上振荡 2 min，离心（5000 r/min）10 min，小心倾出上清液。在沉淀中再加入2 mL MCI-Vaine-Na2EDTA缓冲液，同样方法提取、离心。提取液合并后，用预先活化的C18固相萃取柱进行纯化、富集，吸附速度控制在1mL/min，以3 mL蒸馏水淋洗后，用1 mL的0.01 mol/L草酸甲醇洗脱。洗脱液经0.45μm滤膜过滤后进行HPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

四环素类抗生素属于酸碱两性物质，易与蛋白质强烈结合，提取时需要用酸性物质将蛋白脱除。由于四环素类抗生素在酸性（pH<2.0）或碱性（pH>7）的条件下中易发生降解，在弱酸性溶液中相对稳定。因此，本实验选用了含有EDTA的弱酸性溶剂0.1 mol/L EDTA-McIlvaine缓冲液（pH4.0）作为提取溶剂。

2.2 检测波长的选择

检测波长的选择见图1。利用紫外可见分光光度计在190 nm～400 nm波长范围内进行扫描，得到3种四环素类抗生素的吸收图谱，发现3种抗生素有相似的吸收光谱，在268 nm和350 nm处各有一个吸收峰。分别在两个波长下进行检测，发现在360 nm下基质干扰最小，基线平稳，所以选择360 nm为检测波长。

图1 3种四环素扫描光谱图Fig.1 Scanning spectrum of 3 tetracyclines

2.3 流动相的选择

2.3.1 草酸浓度及pH的选择

综合国内外研究进展发现，流动相中草酸的浓度和pH对于四环素的检测和分析至关重要，因此，本实验中针对此因素进行了比较研究。

四环素类药物结构中活性基团较多,主要以阳离子形式存在，流动相中加入草酸可以与四环素类药物形成离子对，从而降低了对色谱柱硅醇基的吸附，避免拖尾现象。本实验选择用纯水和浓度分别为0.01、0.02、0.03、0.05 mol/L的草酸进行了测试，发现流动相中不使用草酸时，色谱峰严重拖尾，加入草酸后分离度增加，峰形变尖。不同的草酸浓度对分离效果影响不大，因此，本实验选择草酸的浓度为0.01 mol/L。

草酸溶液的pH对组分的分离效果也有一定的影响。本实验分别用pH为2.0、3.0和4.0的0.01 mol/L草酸溶液作为流动相进行了测定，发现三种条件下，三种四环素均能分开，但随pH的降低，各峰间的分离度增大，峰形尖锐，对称性好。如果pH过低（pH＜2.0），四环素会发生降解，同时也不利于色谱柱的保护。因此，本实验选择草酸的pH为2.0。

2.3.2 色谱条件的选择

实验分别采用不同的流动相组成进行了分离效果的对比。结果发现，采用甲醇-乙腈-0.01 mol/L草酸（1.5+1.5+2.0，pH=2）作为流动相进行分析时，出峰时间短，三种四环素保留时间相似，无法分离；采用乙腈-0.01 mol/L磷酸二氢钠（pH2.5）作为流动相，四环素和土霉素无法分离；选用0.01 mol/L草酸-乙腈-甲醇进行三元梯度洗脱，三种四环素得到较好的分离，因此本实验选择三元梯度洗脱。下图2为该色谱条件下，三种四环素标准色谱图和样品添加色谱图。

图2 3种四环素标准色谱图和样品添加色谱图Fig.2 Standard spectrum and added sample spectrum of 3 tetracyclines

从图2可以看到，奶样中的三种四环素类药物均能达到基线分离，分离效果较好。出峰顺序依次为土霉素、四环素、金霉素。以x代表浓度（mg/L），y代表峰面积，测定三种四环素的标准曲线，以3倍信噪比求出检出限。结果见表1。

表1 3种四环素标准曲线的回归分析Table 1 Regression analysis for standard line of 3 tetracyclines

由表1可以看出三种四环素类药物的标准曲线相关性较好，最低检出限均能达到国标的兽药残留最低限量要求。

2.3.3 加标回收率测定

分别吸取5 mL空白奶样于离心管中，各加入不同浓度的相应抗生素混样，加标后用涡沦振荡器振荡5 min混合均匀，在冰箱中放置12 h后提取，使药物均匀扩散到奶中。每个浓度重复3次。结果见表2。

上述结果显示，应用本方法能够有效检测到奶制品中的土霉素、四环素和金霉素等抗生素残留，方法的加标回收率103%～109%之间，变异系数在4.46%～8.55%之间。

表2 奶中三种四环素的加标回收率（n=3）Table 2 Recoveries of 3 tetracyclines in milk(n=3)

2.3.4 C18固相萃取柱反复使用效果的比较

取三种浓度为0.20 mg/L的四环素MCI-Vaine-Na2EDTA缓冲液5 mL，加入到活化后的C18固相萃取柱中，按样品处理方法进行富集、洗脱后，进行HPLC分析。C18固相萃取柱反复使用五次，通过其回收率，确定其反复使用的可行性。结果见表3。

表3 C18固相萃取柱反复使用效果的比较Table 3 Comperison of reuse effectiveness of C18solid extraction column

结果说明，本方法中用于纯化样品的C18固相萃取柱可以多次反复使用，这样的操作有助于降低该方法的分析成本。

同时，在检测中发现，四环素类抗生素在pH＝4的MCI缓冲液中不稳定，在室温下8 h大约损失3%，因此提取物在分析前应保存在4℃冰箱中以降低损失；提取物在-20℃可稳定2 d。由于四环素类对光敏感，因此在整个操作过程中尽量避免日光直射。

3 结论

采用固相萃取纯化，应用梯度洗脱，建立了一种同时检测牛奶中3种四环素类药物残留的HPLC方法。通过流动相构成比较、线性关系、最低检出限以及空白样品加标回收率比较，证明该方法简便可行、结果可靠，可用于对牛奶中四环素类药物残留的检测。

同时通过多次反复实验，证明本方法用于纯化样品的C18固相萃取柱可以多次反复使用，这有助于降低本方法的分析成本，利于方法的推广和应用。

[1]王蕾,徐智秀.反相高效液相色谱法快速测定7种四环素类抗生素[J].分析化学研究简报,2003(1):52-54

[2]宫春波,甄宗圆.鲜乳中抗生素的来源及控制[J].中国乳业,2002(12):33-35

[3]刘军,刘清.牛乳中四环素类兽药残留量的监测调查[J].甘肃科技纵横,2002(5):40

[4]刘伟,沈敏.反相高效液相色谱法测定全血中青霉素类药[J].法医学杂志,1999(2):19-20

[5]李华.奶制品中抗生素的检测[J].福建轻纺,2001(12):5-7

[6]李青,常新.高效液相色谱法同时测定动物组织中3种抗生素残留量[J].中国公共卫生,2002(2):233-234

[7]吕保克.食品分析大全[M].北京:高等教育出版社,1997:882

[8]沈小婉.色谱法在食品分析中的应用[M].北京:北京大学出版社,1992:121

[9]李俊锁,邱月明,王超.兽药残留分析[M].上海:上海科学技术出版社,2002:365

[10]中华人民共和国农业行业标准.中华人民共和国农业部,NY 5029-2001[S].