周先丽，梁成钦，徐庆，刘国雄，苏小建，*

（1.广西桂林医学院，广西 桂林 541004；2.广西师范大学环境与资源学院，广西 桂林 541004）

蛋白酶是目前工业用酶的主要酶制剂之一，占了工业用酶的60%市场份额[1]。蛋白酶在食品、化工、医疗、制药等方面应用广泛[2]。植物是蛋白酶的重要来源，目前生产最多的植物蛋白酶是木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，其广泛应用于食品加工方面，如肉的嫩化等[3]。

罗汉果蛋白酶是本课题组从鲜罗汉果中发现一种新植物蛋白酶，其水解酪蛋白的活力达44.76×103kat/μg[4]。罗汉果（Siraitia grosvenorii）是葫芦科（Cucurbitance）罗汉果属植物的成熟果实，是广西桂林地区的大宗经济作物[5]。罗汉果除了被广泛用于医药外，还主要用于生产罗汉果甜苷。由于近年来罗汉果甜苷广泛应用于饮料和食品产品，从而使罗汉果行业得到了快速发展[6]。本课题组已经初步研究和探讨了罗汉果蛋白酶的提取分离工艺和部分理化性质，如：酶起活性作用的最适条件和酶稳定性的最佳条件等[4，7]。对大豆蛋白的水解条件也进行了初步探讨[8]。为了获得更多的纯罗汉果蛋白酶和测定其更多的性能参数，为开发利用该酶提供更充分的实验依据，在本实验中，我们探索了新的分离纯化方法，采用硫酸铵盐析，CM Sepharose FF离子交换柱层析，Sepahcryl S-200 HR和Sepahcryl S-100 HR凝胶过滤柱层析等手段，对罗汉果蛋白酶进行了分离纯化，并对纯化得到的罗汉果蛋白酶进行了纯度、分子量和等电点（pI值）测定。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

罗汉果：购于广西桂林永福；三羟甲基氨基甲烷（Tris）：Augus公司产品；十二烷基磺酸钠（SDS）：Biomol公司；四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺、双丙烯酰胺：Promega；牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-25、低分子量标准蛋白(14.4 ku～97.4 ku)、卵蛋白、等电聚焦标准蛋白、CM Sepharose FF、Sepahcryl S-200 HR、Sepahcryl S-100 HR：Amersham Pharmecia Biotech 公司产品；Shim-pack DIOL-300为天津市先明科技发展有限公司产品；Symmetry C18柱为Waters公司产品；其他试剂均为分析纯试剂。

电泳仪（DYY-Ⅲ5）：北京六一仪器厂；冷冻干燥机（JDY-A）：吉林大学仪器技术发展公司；精密pH计（pHS-3C）：上海精密科学仪器有限公司；蛋白分离基本系统（AKTA prime）：Amersham Pharmecia Biotech；高效液相色谱仪（Waters600）：双波长紫外检测仪（2487）：Waters公司；UV2401紫外分光光度计：Shimadzu公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白酶的活性测定

罗汉果蛋白酶酶活力的测定方法见参考文献[9]，以干酪素为底物。酶的活力单位定义：在规定条件下，1 min内酶水解酪蛋白释放出相当于1μg/mL酪氨酸在275 nm波长处的吸收度为1个活力单位。

1.2.2 蛋白质的含量测定

采用Bradford检测法,参考文献[10]进行。

1.2.3 罗汉果蛋白酶的分离纯化

1.2.3.1 硫酸铵分级沉淀罗汉果蛋白酶的研究

将鲜罗汉果洗净，粉碎，匀浆，冷冻离心（8000r/min，4℃）10 min，取上清液得罗汉果汁。取200 mL果汁用蒸馏水稀释到700 mL，分成7等份，分别加入固体硫酸铵使其饱和度分别达到0%、20%、35%、50%、65%、80%、100%，静置，然后冷冻离心（4℃，8000 r/min）15 min，分别取上清液，并以硫酸铵饱和度为0的果汁的蛋白质浓度和酶活力为100%分别测定计算各上清液的蛋白质相对浓度和相对酶活力。

1.2.3.2 罗汉果粗酶的制备

取适量罗汉果汁，以1.2.3.1确定的最佳硫酸铵到饱和度沉淀罗汉果蛋白酶，然后用适量的0.05 mmol/L Tris-HCl（pH 7）缓冲液（含1 mmol/L EDTA）溶解，再用上述缓冲液透析过夜至用1%的BaCl2溶液检测不到沉淀，再冷冻干燥得罗汉果粗酶。

1.2.3.3 罗汉果蛋白酶的CM Sepharose FF柱层析

取4 g粗酶溶于15 mL 0.05 mmol/L HAc-NaAc（pH 4.3）缓冲溶液中，上样于已用0.05 mmol/L HAc-NaAc（pH 4.3）缓冲溶液平衡的CM Sepharose FF阳离子交换柱（2.6 cm×70 cm），再用上述缓冲液洗脱，至洗脱液在280nm的紫外吸收低于0.02为止，再用0.05mmol/L～1 mmol/L HAc-NaAc（pH 4.3）缓冲溶液连续梯度洗脱，总洗脱体积为4300 mL，流速为1 mL/min，280 nm紫外吸光检测，记录，11 mL每管收集蛋白峰，0.05 mol/L的Tris-HCl（pH 7）缓冲液（含1 mmol/L EDTA）透析过夜，再冷冻干燥，得罗汉果蛋白酶样品。

1.2.3.4 罗汉果蛋白酶的Sepahcryl S-200 HR柱层析

将1.2.2.3所得蛋白酶样品溶于5 mL 0.15 mol/L HAC-NH4AC缓冲液（pH 6.5），再上样于已用上述缓冲溶液平衡的SepahcrylS-200HR凝胶柱（2.6cm×70cm)，用初始缓冲液以0.6 mL/min流速洗脱，280 nm紫外吸光检测，记录，6 m每管收集蛋白峰，0.05 mol/L的Tris-HCl（pH 7）缓冲液（含1 mmol/L EDTA）透析过夜，所得酶液经冷冻干燥，得罗汉果蛋白酶样品。

1.2.3.5 罗汉果蛋白酶的Sepahcryl S-100 HR柱层析

将1.2.2.4得蛋白酶溶于1.5 mL0.15 mol/L HACNH4AC缓冲液（pH 6.5），再上样于已用上述缓冲溶液平衡的Sepahcryl S-100 HR凝胶柱（1.6 cm×80 cm），用初始缓冲液以0.6 mL/min流速洗脱，280 nm紫外吸光检测，记录，每管5 mL收集蛋白峰，0.05 mol/L的Tris-HCl（pH 7）缓冲液（含1 mmol/L EDTA）透析过夜，所得溶液经冷冻干燥，得纯化的罗汉果蛋白酶。

1.2.4 罗汉果蛋白酶的纯度分析

将罗汉果蛋白酶配成浓度为10 mg/mL的溶液，采用凝胶HPLC和C18-HPLC分别进行纯度分析。凝胶HPLC条件为：Shim-pack DIOL-300柱，流动相为50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0），流速为1 mL/min，280 nm紫外检测，室温，20μL进样；C18-HPLC条件为：Symmetry C18柱，流动相为分别含20%乙腈和40%乙腈的0.1%三氟乙酸溶液阶段梯度洗脱40 min，流速为1 mL/min，280 nm紫外检测，室温，20μL进样。

1.2.5 罗汉果蛋白酶的分子量测定

用SDS-PAGE和Sephacryl S-100 HR凝胶柱层析两种方法测定罗汉果蛋白酶的分子量。SDS-PAGE测定条件[10]：12%的分离胶，5%的堆积胶，10 mA稳流电泳30min，考马斯亮蓝染色15min，脱色过夜。Sephacryl S-100 HR凝胶柱层析测定方法：将1 mL 1 mg/mL纯化的蛋白酶液和1 mL混合标准蛋白液分别上样于0.15mol/LHAC-NH4AC缓冲液（pH6.5）平衡的Sepahcryl S-100 HR 凝胶柱（1.6 cm×80 cm），并用此缓冲液以1 mL/min流速洗脱，280 nm紫外吸光检测，记录，收集蛋白质峰，测量各峰的洗脱体积。以洗脱体积为横坐标，洗脱液的紫外吸光度为纵坐标分别作曲线图。

1.2.6 罗汉果蛋白酶等电点的测定

用聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定，凝胶浓度5%，交联度3%，甘油10%。正极电泳液0.04mol/LDL-asparticacid，负极电泳液0.1mol/LNaOH，电压1000 V，电流50 mA，电功率为30 W，预电泳30 min后去除加样条再电泳约3.5 h至电流恒定，考马斯亮蓝R-250染色。

2 结果与讨论

2.1 硫酸铵分级沉淀罗汉果蛋白酶的研究

用不同饱和度的（NH4）2SO4沉淀罗汉果蛋白酶，结果如图1所示。

当（NH4）2SO4饱和度为50%时，上清液蛋白酶活力仅保留6.3%，而蛋白保留率为52%，说明此硫酸铵浓度罗汉果蛋白酶大部被沉淀下来，因此本实验采用50%饱和度的（NH4）2SO4为制备罗汉果蛋白酶的盐析条件。

2.2 罗汉果蛋白酶的分离纯化

罗汉果汁经硫酸铵盐析、CM Sepharose FF柱层析（图 2）、Sephacryl-200 HR 柱层析 （图 3）、Sephacryl-100 HR柱层析（图4）等操作后，结果如表2所示。得到的活性蛋白酶比活力达到9.4×107kat·g，回收率为4.2%，纯化倍数为31.1倍，经SDS-PAGE检测显示为一条蛋白酶带（图8）。

2.3 罗汉果蛋白酶的纯度分析

表1 罗汉果蛋白酶的分离纯化结果Table 1 Summary table of purification of protease

凝胶高效液相色谱在即定的条件下测得样品为一单峰，保留时间为14.33 min，根据测得的峰面积采用归一法可计算出酶纯度为100%（图5）；而C18反相高效液相色谱测得样品在保留时间为44.58 min时出现一个尖锐的峰，根据测得的峰面积采用归一法可计算出酶纯度约为98.8%（图6）。

2.4 罗汉果蛋白酶的分子量测定

用凝胶过滤测得标准蛋白的洗脱体积（图7），制作对数线性图，得出线性公式 y=-67693ln（x）＋365507，将纯化酶的洗脱体积122 mL代入公式，得该酶分子量为40.3 ku；用SDS-PAGE测得标准蛋白的迁移率（图8），制作对数线性图，得线性公式为y=-49275ln（x）－2543.7，将纯化酶的迁移率0.43代入公式得分子量为39.0 ku，与前者的分子量基本一致，可初步确定该酶分子量可能处于39.0 ku～40.3 ku之间。

2.5 罗汉果蛋白酶等电点的测定

等电点与分子量一样，也是蛋白质重要的的理化参数之一，一般利用等电聚焦电泳来测定。罗汉果蛋白酶纯化产物的等电聚焦结果如图9所示。

图9 罗汉果蛋白酶的等电聚焦图谱Fig.9 Isoelectric point determination of protease by IEF-PAGE

从等电聚焦结果可以看出，该蛋白酶的等电点较高，大约为pH 8.55。

3 结论

本实验经过一系列的分离纯化操作步骤后得到的罗汉果蛋白酶比活力达94.0kat/g，活性回收率为4.2%，提纯倍数为31.1倍，与文献[4]相比，纯化的酶活力提高了1倍左右，而回收率相差不大，但纯化倍数提高了约16倍。纯化的罗汉果蛋白酶活力远远高于已报道的纯化得到的植物蛋白酶（木瓜蛋白酶[11]6.2 kat/g，生姜蛋白酶[12]0.0035 kat/g，菠萝蛋白酶[13]0.94 kat/g，无花果蛋白酶[14]0.015 kat/g），这进一步说明了罗汉果蛋白酶的高活性。

根据SDS-PAGE和凝胶色谱对蛋白酶分子量的测定，推测该酶可能并不含有二硫键，因此该酶可能只有一个亚基，并由单链组成。罗汉果的等电点为pH 8.55，可能是文献[4]所报道的为何罗汉果蛋白酶有两个最适的起酶活作用的pH，也有两个最适的酶稳定的pH的原因，因为等电点刚好处于它们之间，当pH接近等电点时，酶出现失活。

综合罗汉果蛋白酶的理化性质表明，罗汉果蛋白酶水解活性高，结构特别，稳定性好，且由于罗汉果果实广泛用于食品和医疗工业，其安全性也得到了验证。另外，罗汉果已形成了一定的产业规模，因此罗汉果蛋白酶具有很大的开发利用价值。

[1]Germano S,Pandey A,Osaku C A,et al.Characterization and stability of proteases from Penicillium sp.produced by solid-state fermentation[J].Enzymeandmicrobialtechnology,2003,32:246-251

[2]Gupta R,Beg Q K,Lorenz P.Bacterial alkaline proteases:Molecular approaches and industrial applications[J].Applied microbiology and biotechnology,2002,59:15-32

[3]刘凤瑶,廖劲松,齐军茹,等.木瓜蛋白酶与菠萝蛋白酶的产业开发[J].食品工业科技,2008,29(7):289-292

[4]苏小建,梁成钦,何星存,等.罗汉果蛋白酶的分离纯化和特性研究[J].食品科学,2007,28(5):249-253

[5]李典鹏,张厚瑞.广西特产植物罗汉果的研究与应用[J].广西植物,2000,20(3):270

[6]黎海彬,王邕,李俊芳,等.罗汉果的化学成分与应用研究[J].食品研究与开发,2006,27(2):85-87

[7]苏小健,梁成钦,何星存,等.罗汉果蛋白酶的提取方法比较[J].食品工业科技,2007(2):157-162

[8]梁成钦,苏小建,徐庆,等.罗汉果蛋白酶水解大豆蛋白的研究[J].食品工业科技,2007,28(12):148-152

[9]Stellmach B.酶的测定方法[M].钱嘉渊译.北京:中国轻工业出版社,1992:229-231

[10]汪家政,范明.蛋白质技术手册[M].北京:科学出版社,2000:8

[11]乙引,张显强,唐金刚,等.木瓜蛋白酶的纯化和性质[J].贵州师范大学学报,2002,20(1):11-14

[12]代景泉,黄雪松.生姜蛋白酶的分离纯化[J].食品科学,2003(2):73-79

[13]李兴,林哲甫.果菠萝蛋白酶用TiO2多孔陶瓷柱层析结合超滤法纯化的研究[J].中国医药工业杂志.2002,33(3):121-123

[14]邱业先,刘勇.无花果蛋白酶的分离纯化及其理化性质研究[J].江西农业大学学报,1996,18(1):46-50