孙金旭

（衡水学院生命科学系，河北 衡水 053000）

覆盆子（raspberry）又称树莓、大号角公，蔷薇科悬钩子属浆果植物。主产于浙江、福建、四川、陕西、安徽、江西、贵州等地。覆盆子果实富含氨基酸、矿质元素、有机酸和VE[1-2]人体必需的营养素外，还含有黄酮、多糖、粗三萜等功能性物质。

目前对于黄酮提取的方法主要有水煎煮法、乙醇提取法、加助溶剂提取法、超声波法、超滤法、微波提取法、高速逆流色谱法、亚临界水提法等多种方法[3]。各种方法各有优缺点，该实验对乙醇提取法进行了研究，采用单因素和响应面试验，优化了覆盆子黄酮提取的工艺条件。

1 材料与仪器

1.1 材料

覆盆子干果（一级品）：购于衡水市中医院药店，净制粉碎过40目筛，50℃烘干备用。样品成分分析中所用化学试剂均为分析纯或生化试剂。

1.2 仪器

XFB-200粉碎机：湖南忠诚制药机械厂；HH-6恒温水浴锅：上海康华生化仪器厂；Uitrospec 3300 pro紫外可见分光光度计；美国GE公司。

2 方法

2.1 总黄酮含量的测定[4]

样品液测定方法为：（1）准确量取待测液5.00 mL，其余操作同标准曲线绘制的测定方法，测定待测液吸光度。（2）准确量取待测液5.00 mL，加入芦丁标准品溶液2.00 mL，其余操作同标准曲线绘制的测定方法，测定混合液的吸光度。（3）测定标准曲线见图1。

由标准曲线可知芦丁含量与吸光度存在良好的线性关系。 总黄酮浓度计算公式为：

式中：A为分光光度法测定覆盆子提取液吸光度值；C为覆盆子提取液黄酮浓度，（mg/mL）；B为覆盆子黄酮提取量，（mg/g）；V为覆盆子黄酮提取液总体积，mL；Z为覆盆子干果总质量，g。

2.2 各单因素对黄酮提取率的影响

选定不同浓度乙醇、提取时间、温度等3个因素，主要以总黄酮提取率作为指标，进行单因素试验考察。

2.3 响应面法优化黄酮提取因素水平

响应面法优化黄酮提取因素水平，见表1。

表1 响应面法黄酮提取因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface for flacone extracting

3 结果与讨论

3.1 乙醇浓度对黄酮提取量的影响

称取覆盆子干果10 g分为6份，粉碎至粒度为（300μm～400μm），放入烧杯中，按 50%、60%、70%、80%、90%、100%的比例将乙醇分别加入1∶10的料液中，80℃下，提取6 h，测定黄酮浓度，结果如图2所示。

由图2可知，随乙醇浓度不断增加，提取黄酮浓度不断增大，当乙醇浓度为70%，黄酮浓度达到最大，为2.01 mg/g，之后随乙醇浓度增加，黄酮浓度反而下降，因此，70%的乙醇浓度为最适覆盆子黄酮提取的浓度。

3.2 浸提温度对黄酮提取量的影响

称取覆盆子干果10 g，分为6份，粉碎至粒度为（300μm～400μm），放入烧杯中，料液比例为 1∶10，乙醇浓度70%，提取时间6 h，提取温度分别为50、60、70、80、90、100 ℃，提取结束后测定黄酮浓度，结果如图3所示。

由图3可知，随浸提温度不断升高，黄酮提取浓度不断增加，当浸提温度为90℃时，黄酮浸提浓度达到最大为2.15 mg/g，之后黄酮浸提浓度有所下降，因此，90℃为黄酮浸提的最适温度。

3.3 浸体时间对黄酮提取量的影响

称取覆盆子干果10 g，分为6份，粉碎至粒度为（300μm～400μm），放入烧杯中，料液比例为 1∶10，乙醇浓度70%，提取温度90℃，浸体时间分别为4、5、6、7、8、9 h，结果如图 4 所示。

由图4可知，随提取时间的延长，黄酮提取浓度也依次增加，到8 h时，黄酮提取浓度达到最高，最高提取量为2.23 mg/mL，当高于8 h时，黄酮提取浓度下降，故8 h的提取时间为黄酮提取的最佳时间。

3.4 黄酮提取工艺优化

3.4.1 覆盆子黄酮提取响应面数据方案及结果

根据单因素试验结果，考虑到实验的可操作性，将料液比例设定为1∶15，采用响应面分析法进行设计，对提取温度、提取时间、乙醇浓度三因素三水平共15个试验点（3个中心点）的响应面分析试验，运用SAS软件的 RSREG（Response surface regression）程序对15个试验点的响应值进行回归分析。以覆盆子干果黄酮提取浓度为响应值，经回归拟合后,确定函数表达式。试验结果见表2。

表2 响应面数据方案及试验结果Table 2 The data plan and result for response surface

3.4.2 模型的建立与显著性检验

对回归方程进行显著性检验、方差分析及各因素最佳点值分析，采用SAS RSREG程序对表3数据进行ANOVA分析，结果见表3。

表3 三因素三水平中心组和参数估计Table 3 The parameter estimating and central division for three facters and levels

续表3 三因素三水平中心组和参数估计Continue table 3 The parameter estimating and central division for three facters and levels

该方程回归显著，模型的复相关系数的平方即R2=97.64%，说明回归方程的拟合程度良好，失拟较小，可以用该方程代替真实实验点进行分析。由表3中的 P 值可知道，方程中 X1、X2、X3、X1X1和 X3X3对 Y值的影响达显著水平，表明实验因子对响应值不是简单的线性关系，二次项对响应值也有很大的关系，这和模型回归中的线性和平方项影响显著相对应。交互项系数均不显著，所以交互作用的影响相对较小。失拟项的p=0.2320，没有显著性影响，说明数据中没有异常点，不需要引入更高次数的项，模型适当。

用Design Expert软件对表2中的数据进行多元回归拟合，选择对响应值显著的各项，可得提取乙醇浓度、提取时间、提取温度与黄酮提取浓度之间的多项回归方程，回归方程为:

通过软件分析，得到覆盆子黄酮提取量最大时X1=0.1173；X2=0.3927；X3=0.2663 计算得到最佳工艺条件为：乙醇浓度91%，提取温度74℃、提取时间8.3 h。此条件下，黄酮提取量为2.54 mg/g。为检验响应曲面法所得结果的可靠性，采用上述优化提取条件进行提取试验，实际测得的平均值为2.53 mg/g，与理论预测值相比，其相对误差约为1%，因此，基于响应曲面法所得的覆盆子干果黄酮提取工艺参数准确可靠，具有实用价值。

4 结论

实验证明响应面方法是优化发酵条件非常有效的工具，Box-Behnken实验设计能建立主要因素影响覆盆子黄酮提取的二次多项数学模型，并利用统计学方法对该模型进行了显著性检验，优化了内在因素水平，找出最佳值。本研究经响应面方法优化，得出产覆盆子黄酮提取的最佳工艺参数为：乙醇浓度91%，提取温度74℃、提取时间8.3 h。此条件下，方程预测值和验证试验值相差1%，覆盆子黄酮的最大提取量达到2.53 mg/g。

[1]汪传佳.覆盆子资源开发利用研究综述[J].浙江林业科技,2004,24(1):65-68

[2]李继仁,何冰.覆盆子类22种生药中微量元素的含量分析[J].微量元素与健康究,1999,16(3):29-31

[3]王梅芳,武坚锐.黄芩总黄酮提取工艺的优化[J].基层医学论坛,2006,10(3):967-972

[4]朱会霞,孙金旭,魏淑珍,等.覆盆子保健啤酒的研制[J].食品工业科技，2007,28(10):154-156