刘丹尹东孙惦许旻何明

脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）能激发过度的炎症反应，产生脓毒血症[1]。心脏是脓毒血症中最易受损的主要靶器官之一[2]，因此，为降低脓毒血症的病死率，减轻心脏功能损伤极为重要。本课题组前期在内毒素整体动物模型上观察到，内毒素血症时心肌14-3-3γ表达增加，提示14-3-3γ可能在内毒素所致的心肌损伤中发挥重要作用[3]。本研究拟构建pFLAG-14-3-3γ重组质粒，转染至原代培养乳鼠心肌细胞，旨在从细胞水平探讨其在心肌细胞损伤中的作用，并进一步检测凋亡的重要调节因子Bax的表达与分布，深入探讨14-3-3γ的保护机制。

1 材料与方法

1.1 受试药品与主要试剂 pFLAG-CMVTM-4质粒（Sigma公司），限制性内切酶 Eco RⅠ和 KpnⅠ（NEB），逆转录试剂盒、T4 DNA连接酶、凝胶回收试剂盒及无内毒素质粒提取试剂盒 （Promega 公司），14-3-3γ 抗体、Bax抗体、β-actin 抗体及相应二抗 （Santa Cruz），线粒体分离试剂盒 （Biovision公司），LipofectamineTM2000 （Invitrogen），MEM 培养基（GIBCO BRL公司产品），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），增强化学发光印迹试剂和硝酸纤维素膜（Amersham公司），胰酶、MTT、HEPES、PMSF、亮肽素,丙烯酰胺、SDS，亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、EDTA和 DTT（Sigma公司产品），其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 心肌细胞的分离培养 参照文献[4]方法略加改进，以下操作均在超净台内进行。取出生1～3 d的SD乳鼠，开胸取出心脏，分离心室组织，经0.1%胰酶消化分离，用含15%胎牛血清的MEM培养基混悬后置CO2培养箱（5%CO2，37℃）培养2 h去除成纤维细胞，台盼蓝鉴别细胞存活率在90%以上者用于实验，然后按5×105/孔、1×104/孔分别接种于6孔培养板和96孔培养板内，CO2培养箱培养，隔天换培养液，前3 d加入终浓度为0.1 mmol/L 5-溴脱氧尿嘧啶核苷 （Brdu）抑制纤维细胞生长。……