何 敏 刘水红 杨志强 高志增

骨肉瘤是原发性骨恶性肿瘤中最常见的一种，约占骨恶性肿瘤的1/3。其恶性程度较高，是严重影响劳动生产力并危及生命的重要肿瘤之一，早期诊断及早期治疗具有特别重要的意义[1]。MicroRNAs（miRNAs）是内源性非编码RNA经过一系列加工后产生的一类大小约20～25个核苷酸单链的小分子RNA，其功能为调控基因转录后的表达[2]。在恶性肿瘤发生发展中，miRNAs扮演着“癌基因”和（或）“抑癌基因”的重要角色[3-5]。本研究拟采用TaqMan MGB探针法检测miR-93在骨肉瘤组织中的表达情况，同时转染miR-93过表达载体及利用反义技术降低骨肉瘤细胞miR-93的表达，观察其生长及细胞周期变化情况，以便为骨肉瘤早期诊治提供新的理论和试验基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料 收集2009年9月—2011年11月南昌大学第一附属医院骨外科38例骨肉瘤及对应软骨组织手术标本，所有标本均经病理学检查确诊，其中男25例，女13例，年龄11～47岁。

1.2 试剂和仪器 TaqMan miRNA分析试剂盒（美国ABI公司）；DMEM高糖培养基（美国Gibco公司）、胎牛血清（美国Hyclone公司）、脂质体 LipfectamineTM2000及真核载体pcDNA5-FRT（美国Invitrogen公司）；反义miR-93寡核苷酸（AMO-miR-93，大连宝生物公司）；人骨肉瘤细胞系 U2-OS和MG-63购自上海中科院细胞库；实时荧光定量PCR分析仪7500（美国ABI公司)，流式细胞仪（美国BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 实时荧光定量PCR检测miR-93的表达 采用Trizol试剂提取组织总RNA，紫外分光光度计测定浓度，-70℃保存备用，用miR-93检测试剂盒检测miR-93的表达。首先取2μg总RNA作为模板与3μL逆转录酶混合，在20μL反应体系中，16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，进行逆转录反应。收集cDNA，然后将cDNA 150倍稀释，取1μL稀释的cDNA与2μLTaqMan引物混合，20μL反应体系：95℃ 10 min，随后 95 ℃ 15 s，61℃ 60 s，40 个循环。……