李建伟，杨 志，刘晓满，吴世华*

1宁波天韵农业开发有限公司，宁波315192; 2浙江大学生命科学学院思源天然药物与生物毒素研究中心，杭州310058

海芦笋及其生物盐中多酚酸和绿原酸的定量分析

李建伟1，杨 志2，刘晓满2，吴世华2*

1宁波天韵农业开发有限公司，宁波315192;2浙江大学生命科学学院思源天然药物与生物毒素研究中心，杭州310058

以绿原酸为对照品，利用紫外分光光度法和高效液相色谱法分别建立了测定海芦笋中多酚酸和绿原酸含量的方法。紫外分光光度法检测波长为338 nm;高效液相色谱法采用Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm ×150 mm，5um)，以甲醇和0.5%冰醋酸水溶液梯度洗脱。结果发现海芦笋及其生物盐中含有大量的多酚酸和绿原酸，其中多酚酸含量分别为6.49 g/kg，3.37 g/kg，绿原酸含量分别为0.234 g/kg，0.180 g/kg。同时也表明高效液相色谱法可用于海芦笋中多酚酸含量的确定。这两种简单快捷的定量分析多酚酸和绿原酸的方法，不仅可用于海芦笋及其生物盐产品的质量控制，而且也为海芦笋的进一步研究和开发提供了一定的依据。

海芦笋;总酚酸;绿原酸;紫外分光光度法;HPLC-DAD;定量分析

海芦笋(Salicornia bigelovii Torr.)属藜科盐角草属植物，原产美州盐沼地［1，2］。一些研究［3-6］表明，海芦笋富含人体必须的8种氨基酸、维生素、食用纤维及微量元素钙、铁、锌、碘等海洋矿物质，也含有高含量的胡萝卜素、维生素C和天然皂苷等多种活性物质，在调节人体酸碱平衡，清除血管壁胆固醇，预防心脑血管疾病等方面具有较好的应用前景。

近年来，人们发现海芦笋具有较强的抗氧化活性［7］，含有一定量的黄酮［8］。黄酮是多酚的一种，是植物产生抗氧化效应的重要原因之一。人们已从其同属植物中分离出一些黄酮等酚性物质［9-12］，但有关海芦笋中的多酚性成分尚未知。最近，我们用液相色谱－电喷雾离子质谱技术发现海芦笋中含有大量的多酚酸类成分，主要是绿原酸等单或双咖啡酰奎尼酸类化合物。本研究拟建立两种定量分析海芦笋中多酚酸和绿原酸的方法，为其质量控制、进一步研究及开发提供一定的依据。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

仪器：UV-2401PC紫外-可见分光光度计;Agi-lent 1100高效液相色谱仪;

试剂：甲醇，0.5%醋酸溶液，绿原酸标准品(中国药品生物制品检定所，批号110753-200413)。冰醋酸(分析纯，杭州华东医药集团)，甲醇(色谱纯，美国默克公司)，超纯水(18.2 MΩ，杭州万洁水处理器制备)。新鲜海芦笋和海芦笋生物盐由宁波天韵农业开发有限公司提供，新鲜海芦笋经装冷冻干燥后粉碎作为样品。

1.2 实验方法

1.2.1 HPLC-DAD法分析海芦笋中多酚酸

色谱条件：色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5um);流动相A：甲醇，B：0.5%醋酸水溶液，梯度洗脱：0～15 min，A从15%增至30%; 15～45 min，A从30%增至45%;45～50 min，A从45%增至100%;然后保持5 min。柱后平衡8 min，再进行下次分析。流速0.8 mL/min，进样量10 μL柱温30℃，检测波长338 nm。

标准曲线的绘制：精密称取绿原酸标准品2.0 mg，用超纯水定容至 25 mL。依次倍半稀释至0.3125 μg/mL，并按上述色谱条件分别进样分析。以浓度x为横坐标，绿原酸对应峰面积y为纵坐标绘制标准曲线。

样品溶液配制及绿原酸含量测定：每次精确称取样品20.0 mg，用超纯水超声溶解并定容至10 mL。在相同的色谱条件下进样，测定海芦笋及其生物盐中绿原酸含量。

1.2.2 紫外分光光度法测定海芦笋中总酚酸含量

标准曲线的绘制：按1.2.1中溶液制备方法配制浓度在0.3125～80 μg/mL的绿原酸标准品水溶液，超纯水做空白对照，用紫外-可见分光光度计于338 nm依次测定其吸光值，以浓度y为横坐标，吸光值x为纵坐标绘制标准曲线。

标准品溶液的配制：按上述配制方法，以绿原酸作为标准品，超纯水为溶剂配制成浓度80 μg/mL的溶液，储存备用。

样品溶液配制及总酚酸含量的测定：同上述HPLC方法配制样品一样，每次精确称取样品20.0 mg，用超纯水超声溶解并定容至10 mL。取配制好样品1.5 mL，于紫外-可见分光光度计中测定总酚酸的含量。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

利用HPLC-DAD法分析海芦笋中的绿原酸及总酚酸含量，绿原酸的浓度和HPLC峰面积呈现良好的线性相关，其线性方程为 y=103.62x，R2= 0.9997，其线性范围：0.3125～80 μg/mL。

分光光度法分析表明绿原酸的浓度与吸光度也呈良好的线性关系，其线性方程为y=0.0302x+ 0.0004，R2=0.9999，线性范围：0.3125～80 μg/mL。

2.2 精密度试验

HPLC-DAD法对同一对照品溶液(10 μg/mL)连续进样5次。其相对保留时间稳定，各峰相对峰面积的RSD 0.17%，表明仪器精密度符合要求。对同一浓度的溶液(40 μg/mL)在紫外可见分光光度计中重复测定5次，结果RSD为0.23%，表明本方法在此条件下精密度良好。

2.3 重复性试验

平行制备5份海芦笋生物盐样品，HPLC-DAD法进样检测绿原酸含量。其相对保留时间稳定，各峰相对峰面积的RSD(3.7%)小于5%，表明试验方法重复性良好。按上述溶液配制方法配制5份样品，在紫外可见光光度计中测定总酚酸。结果(RSD 3.77%)小于5%，表明试验方法重复性良好。

2.4 稳定性试验

HPLC-DAD法对同一样品在24 h内每隔4 h测定绿原酸一次。其结果相对保留时间稳定，各峰相对峰面积的RSD(0.84%)小于5%，表明绿原酸稳定性良好。紫外可见分光光度计法在2 h内每隔30 min测定一次海芦笋生物盐水溶液的吸光值，共测定5次。结果RSD为2.40%，小于5%。

2.5 回收率试验

精密称取同一已知浓度(0.6624 μg/mL)样品9份，平均分为三组，分别加入浓度为5、2.5和1.25 μg/mL的对照品水溶液，混匀，HPLC-DAD法测定其回收率。回收率平均值为96.7%(n=9)，RSD= 3.5%。同样，精密称取同一样品分成两组共6份，分别加入相同体积浓度为40 μg/mL和20 μg/mL的对照品水溶液，混匀，于紫外可见分光光度计中测定其吸光度，计算回收率。测得结果回收率平均值为99.27%(n=6)，RSD 0.94%。

2.6 含量测定

在相同的色谱条件下，测定海芦笋及其生物盐中绿原酸含量。结果测得海芦笋及其生物盐中绿原酸含量分别为0.234 g/kg，0.180 g/kg。

2.7 海芦笋中多酚酸及绿原酸的HPLC分析

由于酚酸及黄酮等具有弱酸性，因此本实验采用酸性的甲醇-水体系。通过细调梯度，结果得到了较好的分离条件。如图1所示，这种条件能较好地分辨出海芦笋中的30余种酚性成分，其中9种酚酸含量相对较高。同步的HPLC-DAD表明这些主要的多酚性成分与标样绿原酸(2)具有相似的紫外吸收，即均在338 nm处有较强的紫外吸收，表明这些成分具有相似的化学结构。因此，我们选择338 nm作为定量波长。

图1 海芦笋干粉的液相色谱图Fig.1 The HPLC and Utraviolet Spectrum of Salicornia bigelovii Torr.powder

表1 海芦笋及其生物盐中多酚酸的含量Table 1 The content of the total phenolic acids in Salicornia bigelovii Torr.and its biosalt production.

利用建立的HPLC定量方法，海芦笋及其生物盐中的绿原酸(2)和其它多酚可以得到准确或相对的定量。如表1所示，与其生物盐相比，海芦笋干粉中除含有绿原酸等单咖啡酰奎尼酸类化合物外，双咖啡酰奎尼酸类化合物更多，这主要是因为双咖啡酰奎尼酸类化合物水溶性比绿原酸等单咖啡酰奎尼酸类化合物的稍小，当用水进行提取时，只有一部分可以溶解，这种原因使得用水提取生产的生物盐中的主要成分是水溶性强的极性成分。因此，如果要提取海芦笋中的多酚酸成分，除了水以外，还应考虑加入一些极性溶剂，如乙醇等。

而且，根据338 nm检测到的峰面积和近似的绿原酸标准曲线，可以近似地定量海芦笋中总的多酚酸的含量，数据见表1。

2.8 海芦笋中总酚酸的紫外分光光度法定量分析

除HPLC-DAD方法外，海芦笋中总酚酸成分的含量进一步用紫外分光光度法证实。如表1所示，海芦笋和生物盐中总酚酸含量分别为6.67 g/kg、3.77 g/kg。这一结果表明，HPLC方法与紫外分光光度法测定的结果相接近。与HPLC法相比，紫外分光光度法可以较快地分析出海芦笋中的总酚酸含量，而且操作简单，便于在工厂应用。但是，HPLC方法可以同时地获得其它所有酚性组分的相对含量，也是一种很有希望的质量控制方法。

3 讨论

多酚是一类重要的抗氧化物，本研究发现海芦笋中含有较高含量的绿原酸等单或双咖啡酰奎尼酸类抗氧化物质，而这可能与海芦笋长期面临盐胁迫生境有关［7，13］。绿原酸被认为是众多药材和中成药的主要有效成分，通常被作为定性甚至定量的指标。如绿原酸是金银花中主要的有效成分，具有显著的清热解毒、抗菌消炎以及防腐等作用［14］。据报道，绿原酸的主要生物活性有：对透明质酸酶及葡萄糖-6-磷酸酶的抑制作用;对自由基的清除及抗脂质过氧化作用;抗诱变和抗肿瘤作用;保肝利胆作用;抗菌、抗病毒及解痉等作用。咖啡酰基奎尼酸具有抗氧化活性、治疗炎症、抑制微生物和病毒活性、酶抑制作用、保肝活性、抗凝血活性等多种生物活性［15］。在药效学上，新发现的绿原酸具有显著活性的药理作用，可为新药开发提供新的思路［16］。作为天然的海水蔬菜，海芦笋因具有这些抗氧化成分而具有更大的优势。而且海芦笋中还含有高含量的Na、K、Ca、Mg等人体必需元素，作为人体的元素平衡用品具有较好的开发应用前景。本研究建立的HPLC和紫外分光光度法对于海芦笋及其生物盐的质量控制具有重要意义，可为海芦笋今后作为一种医药和保健品开发提供一定的安全依据。

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Quantitative Analysis of Phenolic Acids and Chlorogenic Acid of Salicornia bigelovii Torr.

LI Jian-wei1，YANG Zhi2，LIU Xiao-man2，WU Shi-hua2*2Tianyun Agriculture Research and Development Ltd.Corp，Ningbo 315192，China;2Research Center of Siyuan Natural Pharmacy and Biotoxicology，Collage of Life Sciences，Zhejiang UniversityHangzhou 310058，China;

Two methods including the ultraviolet spectrophotometry and the HPLC-DAD had been developed to analyze quantitatively the total phenolic acids and chlorogenic acid of Salicornia bigelovii Torr.，and its biosalt production.The ultraviolet spectrophotometry was set at 338 nm and chlorogenic acid was used as the reference substance.HPLC was performed on a Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5um)using a mobile phase of methanol and 0.5%acetic acid aqueous solution with a linear gradient.It was found that S.bigelovii contained high contents of phenolic acids and chlorogenic acid，and the contents of the total phenolic acids was 6.49 g/kg and 3.37 g/kg for S.bigelovii and its biosalt production，while the contents of chlorogenic acid was 0.234 g/kg and 0.180 g/kg.It was very efficient for quantitative analysis of the total phenolic acids and chlorogenic acid and could be used for quality control of S.bigelovii and its biosalt production.

Salicornia bigelovii Torr.;polyphenols;chlorogenic acid;HPLC;quantitative analysis

1001-6880(2012)04-0494-04

2010-11-30 接受日期：2011-05-27

宁波市科技计划项目(2007C10029)

*通讯作者 Tel：86-571-88206287;E-mail：drwushihua@zju.edu.cn

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