张 茜，郭夏丽，陈 滨，吴学志，戴喜末，罗丽萍

南昌大学生命科学与食品工程学院，南昌330031

不同来源中国蜂胶水提物的化学组成及抗氧化性

张 茜，郭夏丽，陈 滨，吴学志，戴喜末，罗丽萍*

南昌大学生命科学与食品工程学院，南昌330031

本文研究了季节和地理来源对中国蜂胶水提物的化学成分和抗氧化性的影响。分别采集了来自山东、湖北和海南三个省份不同季节的蜂胶，采用改进的提取方法，得到蜂胶水提物(Water extract of propolis，WEP)。分光光度法测定了WEP的主要化学组成，普鲁士兰法和清除DPPH自由基活性法评价了WEP的抗氧化性。研究结果表明，中国WEP含有总酚和总黄酮等化学成分，具有较好的抗氧化性。季节对中国WEP化学成分和抗氧化性有显著影响。山东和湖北WEP化学成分比较接近，但同海南WEP有显著差异，抗氧化活性也显著强于海南WEP。不同产地和不同采收季节的中国WEP存在化学组成及生物活性多样性，在生产实践中需注意这一特性。

蜂胶;水提物;化学组成;抗氧化性

蜂胶(propolis)是蜜蜂从植物的树芽、树皮等部位采集的树脂，再混以蜜蜂舌腺、蜡腺等腺体的分泌物，经蜜蜂加工转化而成的一种胶状物质。其基本成分是50%的树脂(类黄酮和相关的酚酸)、30%的蜡、10%的挥发油、5%的花粉和5%的其他有机成分［1，2］。受胶源植物的影响，蜂胶，特别是来自温带和热带的蜂胶，化学组成存在显著差异［3］。由于蜂胶的多数有效成分容易被醇提取，所以关于蜂胶醇提物的研究报道很多［4，5］。而对蜂胶水提物(Water extract of propolis，以下简称为WEP)的研究报道较少，且研究对象多为巴西蜂胶。巴西绿蜂胶由于性质特殊，用水可以得到更充分的提取［6］，其WEP含有大量的酚酸类化合物。Arjun系统地对比研究了不同国家蜂胶的醇提物和水提物，结果表明，巴西和中国蜂胶的WEP(未说明具体的地区)比其醇提物有更强的DPPH清除能力，而秘鲁和荷兰蜂胶醇提物的DPPH清除能力强于其WEP［7］。WEP具有保肝、免疫调节、抗肿瘤和抗菌等活性［8-10］，且可避免醇提物的副作用［11］，具有很好的应用前景。但目前关于中国WEP化学组成的研究报道还很少［12］。

由于胶源植物不同，导致蜂胶的化学组成和生物活性具有多样性［4，5］。陈裕文等研究表明，季节是影响台湾蜂胶酚类成分的主要生态因子［13］。Bankova研究了不同季节巴西蜂胶的化学成分，结果发现二萜类化合物仅在夏季开始出现，秋季含量达最高，其他季节不存在。但Sforcin的研究结果又表明，季节对巴西蜂胶醇提物的化学组成和抑菌活性没有显著影响［8，9］。综合已有报道可知，季节和采集地对蜂胶的影响不能一概而论，为明确这两个因子对中国蜂胶WEP的影响，本文以分别来自中国三个不同地区及不同季节的蜂胶为实验材料，较为系统地研究了WEP的化学组成和抗氧化活性。研究结果有助于指导生产实践和对中国蜂胶多样性的理解。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蜂胶原胶：采集地和时间分别为山东济宁(6～9月，每月一次，共4个样，分别命名为SD-1～SD-4)、湖北随州(6～9月，每月一次，共4个样，分别命名为HB-1～HB-4)和海南海口(采集时间为5月上旬、中旬和下旬、6月中旬、7月中旬和下旬、8月和10月，共8个样，分别命名为HN-1～HN-8)。将原胶置于-18℃冷冻变硬变脆后，用木锤敲打砸成小碎块，用药材粉碎机粉碎后，放于-18℃中备用。2，4-二硝基苯肼;铁氰化钾;0.2 M pH 6.6的PBS缓冲液;DPPH(Sigma);其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1700pharmaSpec紫外-可见分光光度计：SHIMADZU，日本;SHB-IIIA型循环水式多用真空泵：河南太康教材仪器厂;美国Agilent 1200型高效液相色谱仪，包括在线脱气装置，四元泵，柱温箱，光电二极管阵列检测器(DAD)，G2170BA LC化学工作站。

1.3 实验方法

1.3.1 WEP的提取及配制

对Suzuki［10］蜂胶水提取方法进行了改进。具体方法是：取10.0 g蜂胶在300 mL蒸馏水中混匀，60℃水浴提取7 h。提取液离心 (28 000×g)30 min，收集上清液。残渣采用同样方法再次提取和离心，合并两次上清液，于60℃ 真空减压旋转蒸发浓缩，得固态WEP。固态WEP用蒸馏水复溶，配制成10 mg/mL WEP溶液，经0.45 μm滤膜过滤后置于4℃冰箱中保存，待测。

1.3.2 WEP中可溶性糖、总酚、总黄酮、黄酮醇、黄烷酮的测定

硫酸蒽酮法测定可溶性糖：准确吸取10 μL WEP溶液于试管中，加蒸馏水至1 mL，在冰浴中静置5 min，再加入4 mL 1 mg/mL蒽酮80%硫酸溶液，在沸水浴中煮沸10 min，取出用流水冷却，室温放置10 min，在620 nm处测定吸光值，结果用mgGlu/g表示。

福林试剂法测定总酚［11］：准确吸取20 μL WEP溶液于25 mL容量瓶中，加入3 mL福林试剂，再加入2 mL 200 g/L的碳酸钠水溶液，混匀后用蒸馏水定容，70℃水浴15 min，冷却至室温，于760 nm处测定吸光值，结果以mgGae/g表示。

总黄酮测定［14］：准确吸取50 μL WEP溶液于25 mL容量瓶中，加入无水乙醇至10 mL，再分别加入100 g/L氯化铝水溶液0.5 mL，混匀后用蒸馏水定容，室温静置15 min后，于415 nm处测定吸光值，结果用mgRutin/g表示。

黄酮醇测定［15］：准确吸取100 μL WEP溶液于25 mL容量瓶中，加入95%乙醇至4 mL，再分别加入100 g/L氯化铝水溶液2.5 mL，及1 moL/L醋酸钾水溶液2.5 mL。混匀后用蒸馏水定容，室温静置15 min后，于415 nm处测定吸光值，以50 g/L氯化铝水空白溶液作对照，结果用mgQue/g表示。

黄烷酮测定［15］：准确吸取1 mL WEP溶液于试管中，加入2 mL甲醇，再加入2 mL 1%的DNPH-硫酸溶液，混匀后于50℃水浴1 h。室温冷却后加入5 mL 1% 氢氧化钾溶液，摇匀，静置。取上清液1 mL于25 mL容量瓶，甲醇定容，于495 nm波长处测定吸光值，结果用mgQue/g表示。

1.3.3 HPLC条件［12］

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB C18色谱柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流动相为甲醇－0.1%甲酸，梯度洗脱，其时间程序为：0→10→20→30→60→70→75→80 min。甲醇含量：0% →15% →17% →32%→42%→50%→65%→25%，流速：1.0 mL/ min，DAD检测波长为256 nm和280 nm，进样量20 μL，柱温35℃。

1.3.4 WEP的总抗氧化能力［16］

普鲁士蓝法：WEP溶液用甲醇分别稀释成25，50，100，200，400 μg/mL溶液。分别吸取1 mL各浓度样液加入2.5 mL PBS缓冲液，再加入2.5 mL铁氰化钾溶液;50℃水浴20 min后，加入2.5 mL三氯乙酸，摇匀，取7.5 mL样液，加入同体积双蒸水，再加入1.5 mL氯化铁溶液。摇匀，静置10 min，于700 nm测定吸光值。以芦丁作为阳性对照。WEP总抗氧化能力以WEP浓度－吸光值线性回归方程斜率K表示。

1.3.5 WEP清除DPPH自由基活性［17］

将WEP用甲醇分别释成100，200，300，400，500，600 μg/mL样液。分别取各浓度样液0.1 mL，加入3.9 mL 0.1～0.2 mmoL/L DPPH甲醇溶液(现配现用)，以0.1 mL甲醇作空白。室温黑暗条件下静置90 min后，于517 nm下测定其吸光值。自由基清除率I%=［(A0-AS)/A0］×100。50%抑制浓度IC50可通过自由基清除活性－样品浓度的线性关系求出。抗氧化活性用抗氧化活性指数(AAI)表示。

AAI：抗氧化活性指数;C［DPPH］e：DPPH终浓度，μg/mL;IC50：50%抑制浓度，μg/mL。

1.3.6 数据处理

实验数据3次重复，ANOVA进行方差分析、样品平均数及标准差，SPSS17.0计算相关性及显著性水平。利用国家药典委员会指纹图谱相似度评价系统(2004A版)对HPLC图谱进行分析。

2 结果与讨论

2.1 WEP的化学组成

WEP中可溶性糖、总酚、总黄酮、黄酮醇、黄烷酮的测定结果见表1。

表1 不同来源蜂胶水提物的化学组成Table 1 The chemical compositions of water extraction of propolis

不同地区和季节WEP的化学组成存在显著差异。山东蜂胶WEP以八月(SD-3)总酚含量最高，其次是六月(SD-1)，各月份间差异显著;可溶性糖含量以六月(SD-1)和九月(SD-4)含量最高，显著高于七月(SD-2)和山月(SD-3);总黄酮以六月(SD-1)最高，且各季节间差异显著;黄烷酮含量除七月(SD-2)的显著低于其他样品外，其余三个样品差异不显著;黄酮－黄酮醇含量以六月(SD-1)和八月(SD-3)显著高于其他月份。

湖北蜂胶WEP总酚含量在六月(HB-1)显著低于月份，其他样品差异不显著;可溶性糖含量差异显著，最高的六月(HB-1)是九月(HB-4)四倍之多;总黄酮含量以七月(HB-2)和九月(HB-4)最高，且显著高于六月(HB-1)和八月(HB-3);各月份的黄烷酮含量没有显著差异;黄酮-黄酮醇含量七月(HB-2)和八月(HB-3)显著高于另两个样品。

海南蜂胶WEP总酚含量最高的是7月下旬(HN-6)，是5月上旬含量的两倍，其他时间总酚含量差异显著;各样品之间总黄酮显著差异，以5月中旬和6月样品含量最低;黄酮－黄酮醇以5月上、中旬显著低于其他样品;可溶性糖和黄烷酮的差异小于其它指标。

将同一地区不同季节WEP的各指标进行平均，结果见表1、表 3。总酚含量以山东 WEP最高(515.85±85.76 mg/g)，显著高于湖北，且达海南WEP的10倍之多;山东和湖北WEP中的黄酮-黄酮醇含量接近，均显著高于海南;可溶性糖、总黄酮和黄烷酮三个地区之间没有显著差异。

2.2 不同季节WEP的抗氧化性

山东、湖北和海南不同季节WEP总抗氧化能力及清除DPPH自由基能力结果见表2。

表2 不同来源蜂胶水提物总抗氧化能力及清除DPPH自由基能力Table 2 Total antioxidant and DPPH radical reducing activities of water extraction of propolis of different origins

3个地区不同季节WEP的总抗氧化能力及清除DPPH自由基能力存在显著差异。山东九月(SD-4)的总抗氧化活性较低，但清除DPPH能力显著强于其他样品;湖北六月(Hu-1)的总抗氧化及清除DPPH能力均显著低于同地其它月份;海南5月中旬样品的总抗氧化活性不及同地7月下旬样品的一半，其他时间的样品差异也显著。

将同一地区不同季节WEP的抗氧化活性进行平均，从平均值来看，总抗氧化活性强弱关系为山东WEP＞湖北WEP＞海南WEP，三者之间差异显著。山东和湖北WEP的AAI很高，分别是4.32±0.87和3.77±1.00，Rodrigo［17］指出，当AAI＜0.5时，说明清除DPPH活性弱，0.5＜AAI＜1.0时，活性中等，1.0＜AAI＜2.0时，活性较强，当AAI＞2.0时，则说明活性很强。按此标准，山东和湖北WEP均具有非常的抗氧化活性;而海南WEP仅为0.14± 0.06，没有明显的清除自由基活性。

实验结果表明，来着温带的山东和湖北蜂胶在成分上同热带的海南蜂胶存在显著差异，且抗氧化活性前二者显著强于后者。山东和湖北WEP含有非常多的酚类成分，表现出非常强的抗氧化活性，可以作为天然的抗氧化剂，有很高的利用价值。海南WEP中有效活性成分含量较少，抗氧化活性不明显，使用价值不大。而同为热带的巴西WEP有很强的抗氧化活性。这可能与海南和巴西蜂胶胶源植物不同有关。

从不同地区和季节WEP化学成分和抗氧化活性的结果看，同一地区，季节对蜂胶化学成分和抗氧化活性的影响是很显著的。其原因是，同一地区由于季节更替，优势植被会发生相应变化，由于胶源植物广泛，蜜蜂会有选择性的采取时令植物的分泌物，从而引起蜂胶成分的变化。由于分属于不同气候带，山东、湖北和海南三地的季节及植被变化特点不同，从而导致所在地蜂胶成分和活性的变化规律不尽相同。

2.3 山东、湖北和海南蜂胶水提物的HPLC色谱图相似度

利用指纹图谱相似度评价系统对分别于256 nm和280 nm下获得的HPLC图谱进行分析，16个样品色谱图存在差异，见图1和图2。

图1 三个地区蜂胶水提物256 nm下的HPLC指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprint chromatograms of WEP from three different areas of China at 256 nm

图2 三个地区蜂胶水提物280nm下的HPLC指纹图谱Fig.2 HPLC finger print chromatograms of WEP from three different areas of China at 280 nm

256 nm和280 nm相似度分别在0.030～0.809和0.026～0.844。将山东、湖北和海南三地WEP的图谱同对照指纹图谱对比分析相似度表明(表3)，三地图谱的相似度存在一定差异。其中，山东和湖北差异不显著，但海南与二者差异显著。说明地理位置及气候、植被相似的地区，具有更为相似的蜂胶具体化学组成。

表3 不同地区蜂胶水提物色谱图相似度Table 3 Similarity of chromatography of water extraction of propolis from different areas

3 结论

季节对中国蜂胶水提物的化学成分和抗氧化性有显著影响;山东和湖北同属温带，来自这两地的蜂胶水提物化学成分和抗氧化性比较接近，它们与热带的海南蜂胶差异显著;中国温带地区蜂胶与热带蜂胶水提物比起来具有更为丰富的化学组成和更强的抗氧化活性;海南和巴西同属于热带，但海南蜂胶抗氧化活性明显弱于巴西蜂胶，这可能和植被不同有关。

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Chemical Compositions and Antioxidant Activities of Water Extract of Propolis in Different Seasons and Areas of China

ZHANG Xi，GUO Xia-li，CHEN Bin，WU Xue-zhi，DAI Xi-mo，LUO Li-ping*
School of Life Science and Food Engineering，Nanchang University，Nanchang 330031，China

The aim of this study was to investigate the effects of seasons and collected areas on the chemical composition and antioxidant activity of Chinese propolis.Propolis samples in different seasons from Shangdong(SD)，Hubei(HB) and Hainan(HN)province were collected and underwent the extract procedure by an advanced method and then the water extract of porpolis(WEP)was obtained.The contents of the main chemical compositions of WEP were determined by spectrophotometry，and the antioxidant activities were evaluated by Prussian Blue Method and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)free radical scavenging assay systems.The results showed that WEP in China was abundant in total phenol and total flavonoid，and most WEP had strong antioxidant activity.Seasonal factor had significant impact on the chemical compositions and antioxidant activity of WEP in China.Chemical compositions of WEP from SD and HB Province were similar，but were different from those of WEP from HN Province.Antioxidant activity of the former two WEPs were stronger than the latter.WEP in China collected in different seasons from different provinces varied in terms of chemical compositions and biological activities，which should be taken into account in the practical production process.

propolis;water extracts;chemical composition;antioxidant activity

1001-6880(2012)04-0444-06

2011-06-08 接受日期：2011-11-04

国家自然科学基金项目(310715510，30700105)

*通讯作者 Tel：86-791-3969519;E-mail：lluo2@126.com

S896.6

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