郑小波，何 涛，肖 榕，卿利娟，吴 群，李 婧，葛 亮，郑之琬

（1.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆 荣昌402460；2.西南大学动物科技学院，重庆 北碚400716）

睾丸间质细胞（Leydig Cell，LC），分布于生精小管间的疏松结缔组织中，是合成和分泌雄性激素的主要细胞［1］，大约95%的雄激素是由它合成和分泌的［2］，其分泌睾酮的能力取决于单个细胞的分泌功能和具有分泌功能细胞的数量［3］。从1895年11月8日德国物理学家威.康.伦琴发现X射线100多年来，X射线已用于医疗卫生工作之中。但X射线对使用者和被使用者的危害不容忽视。国内外许多文献报道了X射线与生殖细胞的相关性研究。但是很少报道X射线对性激素生成的影响。猪的睾酮分泌方式与人相似，而且仔猪未成熟的间质细胞在体外能保持较长时间的分泌功能，能更好推测X射线对人睾酮分泌的影响。因此本试验以仔猪为材料，利用体外培养方法，通过不同放射剂量X射线照射睾丸间质细胞，测定睾酮含量变化，同时利用MTT法观察X射线照射对仔猪睾丸间质细胞增殖的影响，从而为探讨X射线对人体生殖影响及其防护提供新的试验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 1640培养基（GIBCO），hCG、牛血清白蛋白（BSA）、I型胶原酶（Sigma公司），睾酮 ELISA 检测试剂盒（ADL）、MTT、DMSO，X射线机（PLX100）。

1.2 试验动物 3周龄长白仔猪，采自重庆畜牧科学研究院。

1.3 试验方法

1.3.1 仔猪睾丸间质细胞的分离和培养 无菌条件下采集3周龄的仔猪睾丸，放入盛有双抗的冰浴PBS中，并迅速送回实验室。进入细胞培养室，酒精擦拭睾丸表面，并用含双抗的PBS清洗3次，剥离被膜，分离出睾丸间质细胞，将睾丸组织剪碎为1 mm大的小块。1 000r／min离心5min，弃上清，加入PBS稀释，重复离心3次。在37℃下，不完全培养基中，胶原酶消化液消化90min，1 000r／min离心5min，留沉淀。将沉淀用PBS进行稀释，1 000 r／min离心5min，留沉淀。用培养液溶解沉淀，移液枪轻轻吹打，使其分散成为单细胞，再用200目细胞筛过滤，滤液用苔盼蓝染色，血细胞计数板计数，根据计数结果将间质细胞浓度调整至1×108细胞／mL，37℃，5%CO2，饱和湿度下培养。培养的细胞进行3β－HDS酶活检测［4］.

1.3.2 照射剂量的处理 根据计数结果将间质细胞稀释至1×108细胞／mL，37℃，5%CO2，饱和湿度下培养48h，将培养的细胞分为5个试验组和一阴性对照组，各组均加入50IU／mL的hCG［5］，再给予试验组不同剂量的X射线照射［6］，试验组照射剂量分别为54kvp、6.4mAs、84.86μGy，66kvp、2.5 mAs、75.83μGy，62kvp、3.2mAs、63.16μGy，73 kvp、1.6mAs、49.96μGy，84kvp、1.0mAs、43.12 μGy，阴性对照组照射剂量为零，X射线发射器与培养物的距离设为150cm，每个处理设3个重复。

1.3.3 照射时间的处理 根据1.3.2的培养方法，将培养的细胞分为3个试验组和一阴性对照组，各组均加入50IU／mL的hCG，选择63.16μGy为试验组照射不同时间的X射线，照射时间分别为0，5，15，30min。

1.3.4 不同时间和剂量的X射线影响仔猪睾丸间质细胞的增殖 加入180μL细胞培养液于96孔板中，使待测细胞密度为10 000～100 000细胞／孔，细胞培养及处理方法同1.3.2和1.3.3，培养48h后分别予以50IU／mL的hCG及不同剂量的X射线照射如表1，每个剂量3个重复。再培养20h后，各组同时加入5g／L的 MTT 20μL；37℃，培养4h；吸去 MTT，加150μL DMSO，37℃，反应15min，酶标仪于450nm波长检测吸光度（A）值。抑制率（IR）%＝（A对照组－A试验组）／A对照组×100%。以抑制率大于30%为敏感［5］。

1.3.5 不同时间和剂量的X射线影响仔猪睾丸间质细胞睾酮分泌 按1.3.2和1.3.3的培养方法及处理方法所得的细胞在相同条件下继续培养24h，1 000r／inm离心5min，收集培养液，待测。取出酶标板，依次加入50μL的标准品于空白微孔中；标记样品编号，并加入50μL样品于空白微孔中；在标准品孔和样品孔中各加入100μL的酶标记溶液；37℃孵育反应1h；用1∶20的浓缩洗液与医用蒸馏水稀释液清洗酶标板5次，每次静置10～20s；再每孔加入底物A、B液各50μL；并在37℃下避光孵育反应15min；每孔加入50μL终止液，终止反应。在波长450nm的酶标仪上测定OD值，绘制标准曲线，利用标准曲线得出各个剂量下的睾酮浓度值（相关系数0.812）。

1.4 统计学方法 用SSPS 16.0统计软件进行统计处理，计量指标满足条件用单因素方差分析，再进行q检验，以P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 不同剂量X射线对仔猪睾丸间质细胞增殖的影响 将仔猪睾丸间质细胞按1.3.2培养及处理后，利用1.3.4的方法，观察不同剂量X射线照射对LC增殖的影响，结果显示，体外培养仔猪睾丸间质细胞对各个照射剂量均敏感，各剂量对细胞增殖抑制率无明显差异（图1）。

图1 不同剂量的X射线照射对仔猪睾丸间质细胞增殖抑制情况

2.2 不同时间X射线照射对仔猪睾丸间质细胞增殖的影响 将仔猪睾丸间质细胞按1.3.3培养及处理后，利用1.3.4的方法，观察不同时间X射线照射对LC增殖的影响，结果显示，体外培养仔猪睾丸间质细胞，在63.16μGy剂量下照射5、15、30min，各组LC增殖均受到抑制，且抑制率随着照射时间的延长而逐渐上升（图2）。

图2 不同时间X射线照射对仔猪睾丸间质细胞增殖抑制情况

2.3 不同剂量X射线对仔猪睾丸间质细胞睾酮分泌量的影响 将仔猪睾丸间质细胞按1.3.2培养及处理后，采用1.3.5的方法，利用睾酮ELISA检测试剂盒，测定睾酮的分泌量。结果表明，在试验组设定的照射剂量下的睾丸间质细胞睾酮分泌量与对照组相比有一定的减少，但差异不显著（P＞0.05）（图3）。

图3 不同剂量的X射线照射后仔猪睾丸间质细胞睾酮分泌情况

2.4 不同剂量X射线对仔猪睾丸间质细胞睾酮分泌量的影响 将仔猪睾丸间质细胞按1.3.3培养及处理后，采用1.3.5的方法，利用睾酮ELISA检测试剂盒，测定睾酮的分泌量。结果显示，在63.16 μGy剂量下5min，体外培养睾丸间质细胞睾酮分泌量与对照组相比差异不显著（P＞0.05），而照射15、30min，睾丸间质细胞睾酮分泌量与对照组相比差异显著（P＜0.05）（图4）。

3 讨论

X射线是具有一定波长和频率，光子能量较大的一种电磁波。X射线可能使物质发生电离，其属于不可见光，不带电，通过三棱镜时不会发生折射。性腺既具有生殖功能也具有内分泌功能，其对电离辐射较为敏感。辐射对性腺的影响可引起不育、性细胞突变、子代异常等。睾丸具有生成精子、分泌睾酮的功能。有报道，男性全身或局部受一定剂量的辐射后，可能会出现精子数量减少及精子活力降低、畸形精子增多，无论是大剂量事故照射或小剂量职业照射都可致性腺损害，从而影响生育［7］。电磁波辐射可影响cAMP蛋白激酶的活性降低，也可能降低细胞内多种酶的活性，当这些酶活性降低就可能会引起细胞增殖停止。据报道［8］，辐射可使中国仓鼠V79细胞克隆减少，而无法进入S期，这一现象与辐射的功率和暴露时间有关，电磁波辐射也可对细胞内的DNA结构和合成造成一定的影响，从而影响细胞增殖。而X射线本质就是一种电磁波，所以试验中仔猪睾丸间质细胞增殖也有可能受到抑制。而长期低强度电磁脉冲作用，可通过积累效应使细胞膜形成电穿孔［9］，从而影响细胞的活性，使细胞的增殖能力降低。本研究的结果发现，试验的各剂量X射线对细胞增殖均有抑制作用，所以长期从事X射线操作的工作人员以及被操作人员都应该做好防护。

图4 不同时间X射线照射后仔猪睾丸间质细胞睾酮分泌情况

X射线可影响睾丸间质细胞的增殖，而睾丸间质细胞主要功能就是分泌睾酮，人体血液循环中最重要的雄激素为睾酮［10］。据报道［11］，人体受50～100Gy照射后的睾丸仍能对垂体促性腺激素起反应，0.75～6Gy照射人体的睾丸，血清睾酮的浓度无明显变化。而本次试验的X射线的照射剂量中的最大剂量为84.86μGy，各个辐射剂量下所分泌的睾酮量与对照组的分泌量差异不显著（P＞0.05），一次试验剂量对睾酮分泌的影响不大，所受到的辐射水平很低，因而对性及内分泌功能不会造成较大的影响。值得注意的是长时间低剂量的电磁脉冲，具有积累效应［9］。本试验结果表明，随着辐射时间延长间质细胞增殖的抑制显著增加，而睾酮分泌则显著下降，这与牟翔［12］等的研究结果是一致的。故长时间使用X射线对畜体和人体还是存在安全隐患。所以在使用X射线诊断和治疗疾病时，操作者和被操作者都应注意必要的防护。

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