许建英 李洪秀 王鹏

本实验采用SD大鼠股部肌袋模型，以牛BMG为载体，旨在局部应用rhBMP-2促进成骨的基础上，联合应用不同浓度的辛伐他汀，来观察二者之间的异位诱导成骨效应，从而为探索辛伐他汀在成骨方面的作用提供实验依据(促进、抑制或无作用)，是否能作为rhBMP-2在促进成骨方面具有协同作用的激活物，亦为进一步探索rhBMP-2在促进成骨方面的机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 一般材料 雄性SD大鼠45只，辽宁医学院实验动物中心提供。

1.2 方法 将45只雄性SD大鼠随机分成3组(表1)，A组:高剂量实验组(含15%辛伐他汀+rhBMP-2 0.25 mg);B组:低剂量实验组(含2.5%辛伐他汀+rhBMP-2 0.25 mg);C组:阳性对照组(含rhBMP-2 0.25 mg)。水合氯醛麻醉后，每

1.3 检测指标只大鼠右侧股部去毛。常规消毒后暴露后股部肌袋。A、B、C组动物分别植入相应载体。仔细缝合肌肉、皮肤，麻醉清醒后送回笼养。于术后15、30、60 d处死动物，每组每期5只进行实验检测。

表1 实验动物分组情况

1.3.1 大体观察 对术后第15、30、60天的SD大鼠进行组织块硬度、范围及肢体运动情况的观察。

1.3.2 碱性磷酸酶检测 将所取组织标本清除多余肌肉，将其一半组织称量湿重后(另一半用于组织学观察)，进行碱性磷酸酶(AKP)检测。采用Wilkinson测定方法，测定AKP活性，再除以标本湿重，即得AKP单位组织湿重的活性。

2 实验结果

2.1 大体观察 术后3组SD大鼠均有死亡，其中A组无死亡，B组死亡2只(术后2 d及6 d各一只)，C组死亡5只(术后第2天二只，第3天一只，第5天一只，第20天一只)，均按照相应实验条件予以补充。术后第15天，各组于股后部植入处均可扪及新生硬组织;术后第30天，B组、C组新生硬组织范围变大，硬度增加，A组则无明显变化;第60天，B组、C组组织硬度及范围进一步增加，且C组组织硬度大于B组，A组硬度有所增加，但不及B、C两组。

2.2 碱性磷酸酶检测 AKP含量:三组组织标本AKP含量均于术后30 d达到峰值。第15天A组、B组AKP含量显著低于对照组AKP含量(P＜0.05)，A、B两组间则无明显差别;第30天，A组AKP含量明显低于对照组(P＜0.01)和B组(P＜0.01)，B、C两组间则无明显差别;第60天，各组间AKP含量均无明显差别，且含量均较低。(表3、图3)

表2 标本中AKP水平测定［IU/g(湿重)，()］

表2 标本中AKP水平测定［IU/g(湿重)，()］

注:与对照组比较，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01

组别15 d 30 d 60 d A组 6.98±0.84* 17.65±0.58＊＊9.65±2.14 26.42±1.63 3.11±1.27 2.85±0.86 B组 7.14±1.56* 25.34±1.52 3.02±1.28 C组

3 讨论

本实验三组动物实验中虽然含有相同剂量的rhBMP-2，但AKP表达量不同，说明是由于使用不同浓度的辛伐他汀所致。研究结果显示，rhBMP-2可促进成骨细胞AKP活性增加，术后15 dA组与B组虽可促进成骨细胞AKP活性增加，但作用不及单用rhBMP-2组，术后30 dB组与C组有明显的促进作用而A组则无明显的促进AKP的作用。术后60 d各组间无差别，表达量都很低。表明局部高浓度的辛伐他汀可能会抑制成骨细胞分化成熟，而低浓度的辛伐他汀作用不明显。各组实验中发现AKP活性在术后15 d即有表达，于30 d达到高峰，而此时正是成软骨和软骨细胞出现的时间，这一结果和Sakano等［1］及 Bernard等［2］的实验结果相一致。这些结果提示骨形成开始于软骨溶解之前。而且成软骨细胞的增殖和AKP的表达结果也提示，在软骨形成的早期即已开始了组织矿化的调节。30 d之后，虽然组织矿化仍在进行，但AKP水平在下降。这提示，30 d之后，在新生骨组织中AKP仍然存在，而且发挥着钙结合蛋白的作用［3］。说明软骨形成期AKP的高表达是BMP诱导成骨中组织矿化的先决条件。

［1］Sakano S，Murata Y，Miura T.Collagen and alkaline phosphatase gene expression during bone morphogenetic protein induced cartilage and bone differentiation.Clin Orthopand Related Research，1993，292:337-344.

［2］Bernard B，Bianco P，Bonucci E.Biochemical and immuno-histochemical evidence that in cartilage an alkaline phosphatase is a Ca2+-binding glycoprotein.J Cell Biol，1986，103:1615-1618.

［3］McLean F M，Keller P J，Genge B R.Disposition of preformed mineral in matrix vesicles:Internal localization and association with alkaline phosphatase.J Biol Chem，1987，262:10481-10487.