张 忠，李科玮，毕 阳，王 义，任亚琳，毕 文

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070）

两种兔耳草提取物的体外抑菌作用

张 忠，李科玮，毕 阳*，王 义，任亚琳，毕 文

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070）

短管兔耳草（Lagotis brevituba Maxim）和短穗兔耳草（Lagotis brachystachy Maxim）在传统藏药中具有抑菌消炎的功效。采用琼脂孔扩散法和96孔培养板对倍稀释法测定了这两种植物不同极性溶剂逐级提取物对4种采后真菌和4种腐败细菌的体外抑菌率和最低抑制浓度。结果表明：在供试真菌中，短管兔耳草提取物对F.semitectum和P.expansum具有抑菌活性，短穗兔耳草提取物对P.expansum和A.alternate具有抑菌活性。两种植物的提取物对供试细菌的抑菌活性整体上较强，短管兔耳草提取物对S.aureus和P.fluorescence有抑菌活性，而短穗兔耳草提取物对S.aureus，E.coli，B. subtilis和P.fluorescence都有抑菌活性。提取物对细菌的最低抑菌浓度最低可达0.05g/mL。结论：这两种植物的提取物具有较广的体外抑菌谱和较强的抑菌活性。

兔耳草，抑菌活性，最低抑菌浓度，细菌，真菌

短穗兔耳草（Lagotis brachystachy Maxim）属玄参科兔耳草属植物，藏名直打萨曾，产于海拔2300～4100m的河滩草地、沟边和树林空地，广泛分布于我国青藏高原地区。具有治肺胃淤血、肺结核、血热性化脓症等功效，为常用藏药的上品[1-2]。有关该植物的抗食品腐败菌的活性尚未见文献报道。与其同属的短管兔耳草（Lagotis brevituba Maxim）生长于海拔3000～4850m的高山草甸及倒石堆、碎石带上，藏名洪连，主要分布于青藏高原地区。全草入药，具有解毒、消炎、止泻等功效[3]。但对其抗菌方面的研究尚未见报道。使用化学合成杀菌剂是目前用于防止疾病传播、食品防腐和果蔬采后病害控制的首要措施[4]。病原菌对现有杀菌剂的抗性、环境污染以及因消费不安全食品而造成的棘手的健康问题和消费者对食品品质和安全性要求的日益提高，使得人们越来越努力寻找现有控制措施的互补或替代措施[5-11]。天然抗菌物质既能延长食品的可利用时间，同时能避免因腐败微生物的酶系或代谢所产生的有关健康、安全、风味、质构和色泽等方面产生的问题[12]，因此许多具有抗菌活性的植物提取物成为研究热点[13-15]。本研究用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和甲醇5种溶剂逐级分别提取两种同属藏药植物短穗兔耳草和短管兔耳草，测定各种提取物对4种果蔬采后致病真菌以及4种常见食品腐败细菌在体外条件下的抑制效果，为该两种植物的进一步研究提供基础，为天然抗菌剂的筛选提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试短穗兔耳草（Lagotis brachystachy Maxim）、短管兔耳草（Lagotis brevituba Maxim） 采自青海省化隆县，由本校林学院植物分类学孙学刚教授鉴定，阴干、粉碎后用PE袋（17cm×12cm）包装，4℃保存；金黄色葡萄糖球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、荧光假单孢菌（Pseudomonas fluorescence）、扩展青霉（Penicillium expansum） 由广东微生物研究所购得并在本院采后生物学实验室保藏；互格交链孢（Alternariaalternate）、半裸镰刀菌（Fusarium semitectum）、粉红单端孢（Trichothecium roseum） 由本院生物学实验室从发病果实分离后保藏。

1.2 实验方法

1.2.1 提取物制备 采用索氏抽提连续法进行活性成分提取：各供试植物样称取50g粉末，用滤纸包好装入索氏抽提器，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇进行连续提取，各提取液过滤，并在35～45℃温度范围内减压浓缩至50mL，制备成1g/mL的原液，根据提取溶剂不同分别标记为PE、CE、EE、AE和ME，放置4℃冰箱备用。

1.2.2 菌悬浮液制备

1.2.2.1 真菌悬浮液制备 参照Bi的方法[16]。取25℃下培养10d的带菌PDA平皿一个，加入含0.05%Tween20的无菌水约10mL，用玻璃棒刮下平板上的病原菌孢子，然后转入50mL三角瓶中，在WYX-A微型旋涡混合器上振荡15s，再用双层纱布过滤，用血球计数板计数，算出孢子悬浮液的浓度后，最后稀释至所需浓度1×106cfu/mL。

1.2.2.2 细菌菌悬液制备 采用平板菌落计数法[17]。将供试细菌用接种环接入到50mL无菌水中，充分振荡30min后二倍稀释菌悬液，吸取标记10-4、10-5、10-6的菌悬液各200μL，对号放入无菌平皿中，并用涂布器来回涂匀后转入37℃恒温培养箱中培养48h，选择最合适的平皿计数，并根据公式（每毫升中菌落形成单位（CFU/mL）=菌落数×稀释倍数×5）计算出每毫升菌悬液中菌落的形成单位。

1.2.3 琼脂孔扩散法抑菌活性测定 参照Cakir的方法[18]并修改。将高压灭菌的琼脂培养基（细菌用牛肉膏蛋白胨培养基，霉菌用PDA培养基）趁液态倒入干燥灭菌的直径9cm培养皿内，厚度约为2mm，待培养基冷凝后，加入0.1mL菌悬液并加入少量二甲亚砜，均匀涂布平板，然后用无菌金属打孔器（d=6mm）打成深2mm的小孔1个，用无菌牙签除去孔内琼脂，并用移液枪吸取一滴琼脂溶液封底。分别吸取不同的溶剂提取物0.2mL加入孔内，并用各自的提取溶剂作空白对照（CK）。以上操作均在无菌条件下进行。然后将培养皿置于恒温培养箱中培养（细菌置于37℃恒温培养箱中培养24～48h，霉菌置于28℃的恒温培养箱中培养48～96h）。实验设三个重复，用十字交叉法测量抑菌圈直径，以平均值代表菌落的大小，计算抑菌率。

抑菌率（%）=（处理抑菌圈直径-CK直径）/处理抑菌圈直径×100%

1.2.4 最低抑菌浓度测定（MIC） 采用Eloff法[19]并略做修改。采用5%（v/v）DMSO对各提取原液进行系列二倍稀释，96孔培养板紫外照射10min后，每孔加入100μL查氏培养基（真菌）和牛肉膏蛋白胨培养基（细菌），再加入100μL的系列稀释液和20μL的菌悬液，各浓度设3个重复，最后一列作为对照，加入5%（v/v）DMSO。各孔加入0.5mg/mL的MTT 20μL作为指示剂，盖好培养板并在28℃（细菌37℃）下培养24～48h，观察指示剂颜色变化并记录最低抑菌浓度。

2 结果与讨论

2.1 不同提取物对真菌的抑制活性

短管兔耳草和短穗兔耳草各自的5种提取物对4种供试真菌的抑制活性表现出了较大的差异（图1）。短管兔耳草除石油醚提取物以外的4种提取物至少对一种供试菌有抑制活性，且对敏感菌的抑制率在实验条件下达到40%以上（IR1），其中F.semitectum对三种提取物敏感，P.expansum对两种提取物敏感。短穗兔耳草的提取物对真菌的抑制活性整体上弱于短管兔耳草的提取物（IR2），体现在仅有两种提取物表现出了抑菌活性且仅能对一种菌有效果。从两种植物得到的弱极性的石油醚提取物均无抑菌活性；相同溶剂的两类提取物抑菌谱没有相似性。最低抑菌浓度是在实验条件下提取物发挥抑菌活性的最低浓度。通过96孔板MTT氧化变色的特性测得各种有效提取物对真菌的最低抑菌浓度为0.42g/mL（MIC1和MIC2），这一现象基本和这些抑菌物质的真菌抑菌率相吻合，因为各种有效物质的抑菌率整体上较接近（40%～54%）。另外，基于对倍稀释的最低抑菌浓度测定方法所测得的仅为具体抑菌浓度的粗略值，所以尽管各抑菌物质的抑菌率存在差异，但这一点未能在最低抑菌浓度上得到体现。较为具体的抑菌浓度可通过在粗略值两侧细化稀释梯度而测得，也可通过Dose-Response关系通过回归拟合而求得。

图1 短管兔耳草（1）和短穗兔耳草（2）不同提取物对真菌的抑菌率（IR）和最低抑菌浓度（MIC）Fig.1 Inhibitory ratios（IR）and MIC of various extracts from Lagotis brevituba Maxim（1）and Lagotis brachystachy Maxim（2）to bioassay fungi

2.2 不同提取物对细菌的抑制活性

两种植物的不同提取物对细菌的抑制活性整体上优于对真菌的抑制活性（图2）。短管兔耳草的5种提取物至少对一种供试菌有活性，且抑菌率基本上都高于40%（IR1），但是只对S.aureus和P.fluorescence有抑制活性。相比而言，短穗兔耳草除石油醚提取物外的4种提取物均有抑菌活性，每种供试菌至少对一种提取物敏感（IR2），且其乙酸乙酯、丙酮和甲醇三种溶剂的提取物对三种供试细菌有抑菌活性。从最低抑菌浓度来看，短管兔耳草提取物对两种敏感菌的最低抑菌浓度表现出了很大的差异（MIC1），其中对S.aureus的最低抑菌浓度均为0.42g/mL，而对P. fluorescence的最低抑菌浓度均为0.05g/mL。短穗兔耳草对敏感菌的最低抑菌浓度根据提取物的不同表现出了较大的差异（MIC2）。整体上分析比较不同菌对各种提取物的敏感性，根据敏感提取物的种类数依次为P.fluorescence、S.aureus、B.subtilis和E.coli。关于短穗兔耳草提取物对细菌的抑菌谱和抑菌活性结果与杨云裳[20]等的部分结果存在差异，由于许多因素会影响实验结果，其中包括提取物的制备方法（如有效成分的挥发）、活性成分在植物不同器官的分布（如全株与部分器官的差异）和有效组分的富集程度等。

图2 短管兔耳草（1）和短穗兔耳草（2）不同提取物对细菌的抑菌率（IR）和最低抑菌浓度（MIC）Fig.2 Inhibitory ratios（IR）and MIC of various extracts from Lagotis brevituba Maxim（1）and Lagotis brachystachy Maxim（2）to bioassay bacteria

在一定实验条件下，提取物的最低抑菌浓度和抑菌率反映了该提取物抑菌特性的两个方面：即最低的作用浓度和高于该值的某个浓度下的抑菌率。通常条件下，二者之间没有必然的相关性。但在相似的抑菌动力学关系下，特定浓度下的抑菌率和最低抑菌浓度之间呈反相关系。但是实验条件也会影响到这一关系的建立，其中最为关键的就是提取物在介质中的分散性。因为这些有机溶剂提取物在水相介质中的分散性是影响其活性的主要因素之一，而这种分散性受助溶剂浓度、共存分子的性质等多种因素的影响。另外活性物质剂量与活性强度之间通常存在S型关系。活性测定时提取物的浓度范围等会影响到抑菌率和最低抑菌浓度之间的关系。

对于这些体外具有较强抑菌活性的提取物质，其体内抑菌活性和进一步分离纯化有待进行。这些天然活性提取物如果经过纯化或合理的配方，将可以用于食品腐败菌的控制，另外也可作为合成新的抑菌剂的分子模板。

3 结论

短管兔耳草和短穗兔耳草在传统藏药中有消炎抗菌的用途，有机溶剂对其进行极性梯度提取后获得的提取物在体外具有不同的抑菌活性。在供试真菌中，短管兔耳草提取物对F.semitectum和P.expansum具有抑菌活性，短穗兔耳草提取物对P.expansum和A. alternate具有抑菌活性。两种植物的提取物对供试细菌的抑菌活性整体上较强，短管兔耳草提取物对S. aureus和P.fluorescence有抑菌活性，而短穗兔耳草提取物对S.aureus、E.coli、B.subtilis和P.fluorescence都有抑菌活性。提取物对细菌的最低抑菌浓度最低可达0.05g/mL。两种植物的多种提取物具有较广的抑菌谱和较强的抑菌活性；各种活性提取物的进一步纯化和相关抑菌机理有待进一步研究。

[1]中国科学院西北高原生物研究所.藏药志[M].西宁：青海人民出版社，1991：253.

[2]青海省生物研究所.青藏高原药物图鉴[M].西宁：青海人民出版社，1972：214.

[3]中国科学院西北高原生物研究所.青海经济植物志[M].西宁：青海人民出版社，1987：519.

[4]Tripathi P，Dubey N K.Exploitation of natural products as an alternative strategy to control postharvest fungal rotting of fruit and vegetables[J].Postharvest Biology and Technology，2004（3）：235-245.

[5]Ippolitoi A，Schena L，Pentimone I，et al.Control of postharvest rots of sweet cherries by pre-and postharvest applications of Aureobasidium pullulans in combination with calcium chloride or sodium bicarbonate[J].Postharvest Biology and Technology，2005（3）：245-252.

[6]Smilanick J L，Mansour M F，Gabler F M，et al.Control of citrus postharvest green mold and sour rot by potassium sorbate combined with heat and fungicides[J].Postharvest Biology and Technology，2008（2）：226-238.

[7]Droby S，Wisniewiski M，Macarisin D，et al.Twenty years of postharvest biocontrol research：is it time for a new paradigm[J]. Postharvest Biology and Technology，2009（2）：137-145.

[8]Sanzani S M，Nigro F，Mari M，et al.Innovation in the management of postharvest diseases of fresh fruits and vegetables [J].Arabic Journal of Plant Protection，2009（2）：240-244.

[9]Sharma R R，Singh D，Singh R.Biological control of postharvest diseases of fruits and vegetables by microbial antagonists：a review[J].Biological Control，2009（3）：205-221.

[10]Casals C，Teixido N，Vinas I，et al.Combination of hot water，Bacillus subtilis CPA-8 and sodium bicarbonate treatments to control postharvest brown rot on peaches and nectarines[J]. European Journal of Plant Pathology，2010（1）：51-63.

[11]Prusky D，Gullino M L.Postharvest pathology[M].The Netherlands：Springer，2010：119-135.

[12]Feng W，Zheng X.Essential oils to control Alternaria alternata in vitro and in vivo[J].Food Control，2007（9）：1126-1130.

[13]Lee S H，Chang K S，Su M S，et al.Effects of some Chinese medicinal plant extracts on five different fungi[J].Food Control，2007（12）：1547-1554.

[14]Verastegui A，Verde J，Garcia S，et al.Species of agave with antimicrobial activity against selected pathogenic bacteria and fungi[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2008（7）：1249-1252.

[15]Santas J，Almajano M P，Carbo R.Antimicrobial and antioxidant activity of crude onion（Allium cepa L.）extracts[J]. International Journal of Food Science and Technology，2010（2）：403-409.

[16]Bi Y，Tian S P，Guo Y R，et al.Sodium silicate reduces postharvest decay on Hami melons：induced resistance and fungistatic effects[J].Plant Disease，2006（3）：279-283.

[17]沈萍，范秀容，李光武.微生物学实验[M].第三版.北京：高等教育出版社，1999.

[18]Cakir A，Kordali S，Zengin H，et al.Composition and antifungal activity of essential oils isolated from Hypericum hyssopifolium and Hypericum heterophyllum[J].Flavour and Fragrance Journal，2004（1）：62-68.

[19]Eloff J N.A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria[J].Planta Medica，1998（8）：711-713.

[20]杨云裳，张应鹏，马兴铭，等.藏药短穗兔耳草有效部位的抑菌活性研究[J].时珍国医国药，2006（10）：1884-1885.

Activity of extracts from two kinds of Lagotises against microorganisms in vitro

ZHANG Zhong，LI Ke-wei，BI Yang*，WANG Yi，REN Ya-lin，BI Wen
（College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

Traditional Tibetan Medicine of Lagotis brachystachy Maxim and Lagotis brevituba Maxim imparted antimicrobial and antiinflammatory functions.To investigate the activity of extracts from these two plants against microorganisms in vitro，the agar well diffusion method and 96-well plate double dilution method were utilized to assess the inhibition ratios and minimum inhibitive concentration of their various extracts through successive extraction via solvents with gradient polarity.It showed that among bioassay fungi，F.semitectum and P.expansum were inhibited by some extracts from Lagotis brevituba Maxim and P.expansum and A.alternata were inhibited by extracts from Lagotis brachystachy Maxim.Extracts from both botanical species exhibited stronger inhibition power against bacteria than fungi in general.L.brevituba Maxim extracts inhibited S.aureus and P.fluorescence growth.L.brachystachy Maxim had power against all four bioassay bacteria.The lowest minimum inhibitory concentration of extracts to bacteria was 0.05g/mL.It was concluded that extracts from the two species embodied with broader spectral range and stronger antimicrobial activity.

Lagotis；antimicrobial activity；minimum inhibitory concentration；bacteria；fungi

TS201.2

A

1002-0306（2012）09-0062-04

2011-08-26 *通讯联系人

张忠（1977-），男，硕士，讲师，主要从事天然抗菌活性物质的研究。

国家自然科学基金面上项目（30671465）。