徐毅晖，杨元生，陈 垦，叶 升，陈婧华，杜政委，王 晖(.广东药学院临床医学院内科学教研室，广州 500;.广东药学院附属第二医院，广州 500;.中山大学附属第一医院，广州 50080;.广东药学院中药学院，广州 50006)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是肠道非特异性炎症反应性疾病，以慢性腹痛、腹泻或黏液脓血便为其临床特点，近年来随着人们生活水平的提高，其患病率亦逐年上升。研究显示UC的发病与肠道免疫系统被激活、抗炎与促炎因子失衡密切相关，目前治疗无特效药，深入研究UC的发病机制对探索新药治疗UC有重要意义。人促红素(human erythropoietin，hEPO)是肾脏分泌的具有促进红细胞成熟的细胞因子，被广泛应用于治疗肾性相关贫血。近年研究还发现hEPO有保护组织免受缺血再灌注损伤、抑制炎症反应、改善体液和细胞免疫功能等［1］。本实验通过观察 Th17 相关细胞因子(IL－6、IL－17A)，进而评价hEPO治疗急性UC小鼠的疗效，从而初步探讨Th17在UC发病中的作用以及hEPO治疗UC的可能作用机制，为hEPO治疗UC提供临床理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级BALB/C雌性小鼠30只，6～8周龄，体重22～25 g，由广东省医学实验动物中心提供(动物编号:SCXK(粤)2008－0002，粤监证字 2008A055)。葡聚糖硫酸钠(DSS，Mr:5000，Sigma公司生产);IL－17A、IL－6酶联免疫吸附测定(Elisa)试剂盒(北京鼎国生物有限公司生产);hEPO(4000 IU/支，沈阳制药公司生产)。Anthos 2010型酶标仪(Anthos tabtec instranents公司生产)、切片机(徕卡RM2135)、显微镜和全自动脱水机(上海光学仪器一厂生产)等。

1.2 方法

1.2.1 实验分组与处理:30只BALB/C小鼠随机分为3组:正常组、DSS模型组和hEPO组，每组10只。参照胡仁伟［2］的方法建立小鼠UC模型。禁食不禁水24 h后，正常组自由饮用蒸馏水，其余各组均自由饮用5%DSS(5 g DSS溶于100 mL蒸馏水)7 d。自造模第1 d开始，治疗组给予hEPO 1000 IU·kg－1，用0.9%氯化钠注射液稀释至1 mL，腹腔注射，隔日1次，共4次，第8 d处死所有小鼠，眼球采血备用，分离留取病变结肠组织标本备用。

1.2.2 疾病活动指数(DAI)与结肠病理评分:腹腔给药后每日观察小鼠的体重、大便性状和便血等情况，参考文献进行疾病活动指数(DAI)评分［3］，DAI=(体重下降分数+大便性状分数+便血分数)/3。正常大便为椭圆形小颗粒状;半稀便为糊状但不黏肛门;稀便为液状且黏肛门;大便隐血用联苯胺法检测。将病变结肠标本置于4%甲醛过夜固定、脱水、脱脂后石蜡包埋行常规切片、HE染色，结肠组织病理学评分标准参照文献［4］。

1.2.3 血清IL－6和IL－17A含量测定:采血后室温静置2 h，4℃下12000转离心15 min取上清液，按Elisa试剂盒方法测定血清 IL－6、IL－17A 含量，按照说明书进行操作，酶标仪450 nm检测标本的吸光度值，根据标准品不同浓度的吸光度值绘制标准曲线求出直线回归方程，通过标本的吸光度值代入回归方程得出浓度值。以上操作均重复操作2次取其均值进行统计分析。

1.3 统计学处理

实验所有数据均采用SPSS 16.0统计软件处理，数据用均数±标准差()表示，计量资料中多组间比较行方差分析，两两比较行SNK－q检验，相关分析采用直线回归分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况及DAI评分

正常组小鼠自由饮用蒸馏水后未见明显异常，其余小鼠饮用5%DSS 24 h后均有不同程度的懒动、拱背、厌食、腹泻、体重下降等;DSS组小鼠均解稀便，7只小鼠有肉眼血便，各时间点DAI评分与其余2组比较差异有统计学意义(P＜0.05);hEPO治疗UC小鼠4 d后症状开始缓解，体重先减轻后逐渐增加;治疗7 d，hEPO组小鼠症状明显改善，精神好转，食欲增加，偶有稀便，未见黏液血便，小鼠DAI评分与DSS组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 各组小鼠不同时间点DAI评分及病理学评分，n=10)Tab 1 The scores of colon pathology and DAI in difference time of mouse in each group(，n=10)

表1 各组小鼠不同时间点DAI评分及病理学评分，n=10)Tab 1 The scores of colon pathology and DAI in difference time of mouse in each group(，n=10)

注:与DSS组比较，▲P＜0.05;与正常组比较，△P＜0.05note:vs.DSS group，▲P＜0.05;vs.normal group，△P ＜0.05

组别 DAI评分d1 d4 d病理学评分正常组 0.23±0.231▲ 0.11±0.132▲ 0▲ 0.63±0.5137▲模型组 2.47±0.431△ 2.21±0.314△ 1.00±0.163△ 10.30±1.095△hEPO组 2.01±0.511△ 1.15±0.273▲△ 0.45±0.121▲△ 4.11±0.532▲△

2.2 结肠病理组织学观察

2.2.1 肉眼观察:正常组小鼠结肠未见明显病变，而DSS组小鼠见病变结肠明显充血、水肿，散在肠壁坏死，肠壁与周围组织有不同程度的黏连，沿肠系膜纵轴剪开肠腔见有鲜红或暗红色血性分泌物、肠壁黏膜散在多发糜烂和少许溃疡点，呈弥漫性、连续性分布，病变多集中于乙状结肠段。经hEPO治疗UC小鼠7 d后结肠黏膜病变较模型组明显减轻，仅见部分肠道轻度充血、水肿，未见糜烂、溃疡及出血病灶。

2.2.2 光镜下观察:正常小鼠结肠切片未见明显病理变化，DSS组小鼠病变结肠黏膜可见糜烂、出血、黏膜上皮脱落、坏死及少许溃疡形成，病变主要局限于黏膜层和黏膜下层，病变部位有大量淋巴细胞浸润、杯状细胞减少，部分伴有淋巴滤泡形成及腺体减少或缺失，组织病理学评分明显高于正常组和hEPO组(P＜0.05);hEPO组小鼠结肠病变有明显改善，肠黏膜少量炎细胞浸润，散在轻微糜烂，未见溃疡。各组小鼠结肠组织病理变化见图1，组织病理学评分见表1。

2.3 血清IL-6、IL-17A含量

各组小鼠血清IL－6和IL－17A含量均有不同程度升高，与正常组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);经hEPO治疗后小鼠血清含量均明显下降(P＜0.05)，与DSS组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。IL－17A与IL－6相关分析显示呈正性相关(r=0.913，P＜0.05)。

表2 各组 IL-6、IL-17A 含量，n=10)Tab 2 The contents of IL-6 and IL-17A in serum of mouse in each group，n=10)

表2 各组 IL-6、IL-17A 含量，n=10)Tab 2 The contents of IL-6 and IL-17A in serum of mouse in each group，n=10)

注:与DSS组比较，▲P＜0.05;与正常组比较，△P＜0.05note:vs.DSS group，▲P＜0.05;vs.normal group，△P ＜0.05

组别 IL－6(pg·mL － 1) IL－17 A(pg·mL － 1)正常组 52.199±6.329▲ 79015.271±927.526▲模型组 385.115±95.322△ 204945.153±39518.513△hEPO组 196.236±78.914▲△ 99663.325±8335.195▲△

3 讨论

3.1 小鼠UC模型的评价

图1 各组结肠病理切片图谱Fig 1 The histopathological image of colon in each group

溃疡性结肠炎(UC)是病因未明的胃肠道慢性复发性炎症性疾病，其病因和发病机制尚不完全清楚，且现有的药物对病情控制欠佳，故该病的发病机制和治疗一直是目前科研的热点。良好的UC动物模型是研究的关键，本实验采用DSS诱导小鼠UC模型，出现活动减少、解稀烂便或血便、体重下降等症状，病变结肠出现肠黏膜糜烂、上皮脱落及溃疡形成，固有层炎症细胞浸润，部分炎症浸及肌层，杯状细胞减少甚至消失，隐窝结构破坏等，符合UC病理改变［2］，模型组小鼠病理改变与正常组比较具有统计学意义(P＜0.05，见表1)，表明葡聚糖硫酸钠诱导的UC模型成功且与人类UC的临床表现和结肠病理改变极为相似，具有研究价值。

3.2 Th17细胞因子在UC小鼠发病中的作用

研究已表明Th1/Th2失衡介导的促炎因子与抗炎因子失衡是导致炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)的重要发病机制［5，6］，T细胞是免疫调节的中心环节，在UC发病中的作用已成为人们研究的热点。Th1细胞以表达IL－12和IFN－γ为主，介导细胞免疫;Th2 细胞以表达 IL－4、IL－5、IL－10 为主，介导体液免疫反应。Th17是近来发现的免疫学领域新因子，为IBD发病机制的研究展现了新的前景［7］。CD4+T细胞是介导肠道炎症的主要效应细胞，在UC肠道病变局部浸润且表现出异常的功能状态，Th17是CD4+T细胞的新亚型，其主要形式是 IL－17A，Th17 细胞分化受 IL－6 和 Stat 3 蛋白调节。IL－17 通过细胞外信号调节(ERK)－丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路参与调节肠上皮屏障功能，IL－17可能是引起肠道炎症的潜在因素，IL－17A与受体结合后，通过活化MAP激酶和NF－κB及促进趋化因子(如 MCP－1 和 MIP－2)、环氧合酶－2、组织降解蛋白酶(MMP)等的合成，从而引起炎症浸润和组织损伤，并联合体内适应免疫系统和固有免疫系统，介导细胞外病原体感染、肿瘤、EAE等疾病的发生发展。Kobayashi等证实肠道和淋巴器官中含有IL－17的CD4+T细胞，在人活动性CD和UC的病变肠黏膜的CD3+T细胞、CD68+单核细胞和巨噬细胞中可检测到 IL－17的表达，其血清中 IL－17 含量同步升高［8］，Th17 细胞及其分泌的炎症细胞因子表达增加和Th17细胞功能持续增强与IBD的发生、发展密切相关［9］。本研究显示，建模小鼠血清Th17细胞因子(IL－17A)和IL－6含量明显升高，而DSS组小鼠升高显著，且二者呈正性相关(r=0.913，P＜0.05)，由此结果推测Th17细胞介导的免疫应答在UC疾病发生发展中扮演主要作用。

3.3 hEPO对UC小鼠血清Th17细胞因子和肠道损伤的影响

目前临床治疗UC以糖皮质激素、氨基水杨酸制剂、免疫抑制剂等药物为主，但其长时间服用不良反应多、效果亦欠稳定、停药后易复发等缺点使患者失去治愈该病的信心。深入研究UC发病机制有利于寻求更为理想和有效的治疗药物，hEPO是一个多效性细胞因子，被广泛应用于治疗肾病相关贫血，近年还发现hEPO可以减轻组织损伤，减少炎性因子产物如 TNF－α、IL－1β、IL－6 等，还能有效改善体液及细胞免疫功能，调节 Th1/Th2 平衡等［10－12］，hEPO 的以上特性为其用于治疗UC提供了新的视角和指引，与糖皮质激素等药相比有独特的优势。本研究结果显示，应用hEPO治疗UC小鼠后，hEPO组小鼠的临床症状、组织病理学评分均较DSS组改善明显，血清 IL－6和 IL－17A 水平明显下降(P ＜0.05)，Th17 细胞分化减少，肠道炎症细胞浸润减轻，该结果与Liu等［10］的报道相一致。

本实验得出DSS能成功诱导与人UC发病相似的UC小鼠模型，hEPO可有效下调UC小鼠体内血清IL－6和IL－17A水平，表明hEPO能抑制UC小鼠体内炎症反应。从Th17分化和调节水平看，hEPO可能通过降低血清IL－6水平进而减少Th17分化表达IL－17A、控制肠道炎症和调节过度激活的肠道免疫反应从而使UC得到有效治疗。hEPO值得我们对其临床应用价值进一步探索与研究，以期为UC的治疗开辟新的途径及提供新的药物选择。

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