诺西肽产生菌的菌种选育

2012-11-13刘平

中国医药指南 2012年10期

刘平

（丹东市食品药品检验所，辽宁丹东 118002）

诺西肽（Nosihepide）是由活跃链霉菌（Streptomyces actuosu）产生的一种含硫多肽类抗生素，分子式为C15H43N13O12S6，属硫链丝菌素（thiostrepton）类[1]。它在体内能有效抑制革兰氏阳性细菌的活性[2]。诺西肽目前主要作为饲料添加剂，优点是不被畜禽吸收、在体内无残留，微量加入饲料中就可以提高禽畜的出肉率[2]，并可加入鱼饵中以防止鱼类的坏死性肠炎及加快其生长。国外于20世纪80年代末批准上市，目前日本和法国已将其列为法定饲料添加剂。

1 实验材料

1.1 菌种

出发菌：诺西肽产生菌S.actuosus（由沈阳药大实验室提供）；鉴定菌：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

1.2 药品

亚硝基胍；95%乙醇；糊精；酵母粉；NaCl；CaCO3等

1.3 仪器

摇床（250r/min）；高压灭菌锅；超净工作台；电子天平；恒温水浴；紫外灯箱（紫外灯15W，照射距离40cm）；离心机。

1.4 试剂

1.4.1 亚硝基胍溶液（NTG）

电子天平精确称取NTG于无菌试管中，加入微量N，N—二甲基甲酰胺（DMF）溶解，用适量磷酸盐缓冲液稀释至所需浓度（现用现配）。

1.4.2 展开剂

氯仿：甲醇：醋酸 = 86：12：2（体积比）

2 实验方法

2.1 紫外线诱变

取2ml单孢子悬液于培养皿中，置于紫外灯箱中，在轻微震荡下照射不同时间，立即避光培养1h，经稀释后涂布培养。

2.2 NTG诱变

取单孢子悬液于无菌试管中，加入NTG溶液28℃或40℃水浴，经稀释后涂布培养。

2.3 效价测定

取发酵液以1∶1（V/V）比例加入95%乙醇，37℃浸泡半小时，离心取上清液用生物效价法测定。

图1 死亡率曲线

图2 正变率曲线

图3 死亡率曲线

图4 正变率曲线

3 结果与讨论

3.1 出发菌株的筛选及稳定性考察

对原始菌株S.actuosus进行自然分离，选择在连续传代下仍有较好产抗能力的S-19作为诱变出发菌株。

3.2 紫外线诱变

依实验方法2.1对菌浓为107个/mL的S-19孢子悬液进行不同剂量的紫外线照射处理，以未处理菌液作对照，稀释涂平皿，生长7天后将对照组与处理组的菌落数进行比较可得死亡率如图1所示，不同剂量下的正变率如图2。

由图1可知紫外线照射120s死亡率为99.7%，用较大的作用剂量作用该菌仍有存活，可见此菌对紫外线不十分敏感。由图2可知，在剂量为60秒时正变率最大为19.3%，剂量小于或大于60s正变率均明显降低。由上得出：紫外线对该菌的诱变最佳剂量为60s。

3.3 NTG诱变

3.3.1 NTG诱变作用浓度的选择

依实验方法2.2对菌浓107个/mL的S-19孢子悬液用不同浓度的NTG溶液水浴处理，以未处理菌液做对照，稀释涂平皿，生长7d后将对照组与处理组的菌落数进行比较可得死亡率如图3所示，不同作用浓度下的正变率如图4。

由图2可知当NTG的作用浓度为3mg/mL时死亡率为99.99%趋近完全死亡，可见此菌对NTG作用较敏感。由图3可知，在NTG浓度为时正变率最大为23.2%，浓度小于或大于1mg/mL正变率较低，尤其随着浓度的加大正变率明显降低。实验中发现：浓度过大不仅死亡率很高、正变率降低、负变率明显增加，而且菌落形态、产孢子情况、色素颜色、生长速度发生很大的变化。由上得出：此菌对NTG作用较敏感，较佳的作用浓度为1mg/mL。

3.3.2 NTG诱变的最佳作用条件的选择

影响NTG诱变作用的因素不仅是NTG的作用浓度，还包括：NTG作用的pH、作用时间、作用温度等。通过正交实验可以确定最佳作用条件。正交实验设计方案见表1，结果及分析见表2。