刘小川，雷亚宁

(1.嘉鱼县血防医院检验科，湖北嘉鱼437200;2.湖北科技学院基础医学实验教学中心)

速可眠具有镇静、催眠及抗惊厥作用，通常用于催眠，尤适宜于入睡困难者，也用于紧张、焦虑不安、过度兴奋，以及麻醉前和手术前的镇静作用［1］。速可眠久用可产生依赖性［2］，故不可滥用。大剂量对心血管系统和呼吸系统有明显的抑制。过量可麻痹延髓呼吸中枢而导致死亡，当血药浓度超过7μg/ml［3］，即产生中毒反应。日常生活中容易获得，故在刑事案件中经常遇到投用此类药物作案的案例，临床中误服过量该类药物的病例也时有发生，因此，检测生物样本中速可眠的浓度在临床检验和法医毒物分析中具有重要的意义。

目前检测方法主要有毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)［4］、气相色谱法(gas chromatography，GC)［5］、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)［6］和高效液相色谱－质 谱 法 (liquid chromatograph－Mass spectrometer，LC－MS)［7］。由于生物样品中成分复杂，且速可眠药物极性较强，CE、GC和HPLC方法难以满足速可眠灵敏准确的定量分析要求。与LC－MS目前常用的电喷射离子化质谱法相比，GC－MS采用电子轰击或化学电离方式，能减少生物样品检材成分复杂基质的干扰［8］。本实验建立了GC－MS检测速可眠的方法，利用气相色谱毛细管柱的高分离性能和质谱准确的鉴定化合物的能力，采用选择离子模式(SIM)定量，在减少了干扰物影响的同时，提高了检测的灵敏度，取得了很好的结果。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 7890A/5975C气相色谱－质谱仪(美国Agilent公司)，配有电子轰击离子源(EI)及化学工作站;氮吹仪(大连依利特分析仪器有限公司)。速可眠标准品(1.0mg/ml)购自上海司法部司法鉴定科学技术研究所;甲醇、乙醚购自天津四友精细化学试剂公司，所有试剂均为分析纯，所有溶剂均用去离子水配制。

1.2 样品前处理

取空白血液样品1ml置于10ml离心管中，添加速可眠标准品2μl，加1滴1.0 mol/l HCl溶液使呈酸性(pH值2～3)，用乙醚3ml涡旋混合提取1min，离心使之分层，转移出乙醚提取液于5ml试管中，残留液中再加10%NaOH溶液2～3滴，使检材呈碱性(pH值11～12)，用乙醚3ml提取残留液，涡旋混合1min，离心使之分层，转移乙醚层，合并乙醚提取液，于60℃水浴中挥发至近干，残留物加50 μl甲醇溶解，取1μl进样。

1.3 色谱条件

色谱柱(HP－5MS 30m ×0.25mm ×0.25μm);进样口温度:200℃;传输线温度:280℃;色谱柱程序升温:初始温度100℃，保持1.5min，以25℃/min升到280℃，保持15min;载气:氮气，恒流模式，流速2.0ml/min;不分流进样，进样量1.0μl。

1.4 质谱条件

电子轰击源(EI)，电子能量:70eV，离子源温度:230℃，四级杆温度:150℃;电子倍增器电压:1326V;扫描质量范围:m/z 50～400;扫描方式:选择离子扫描(SIM)模式;选择离子分别为 m/z 168，195，239。

2 结果

2.1 血液样品中速可眠的色谱图和质谱图

分别按1.2节所述方法预处理空白血液和空白血液添加2μg/ml速可眠血液后，采用SIM扫描检测，在保留时间7.38min处，空白添加血液液中出现速可眠色谱峰，色谱峰峰形较好，分离完全，空白血液中的内源性物质不干扰样品峰。图1A、1B分别为空白血液和空白血液中加入速可眠标准溶液后按照本文建立的方法进行测定得到的色谱图，图2为速可眠质谱图。其特征离子分别为 m/z 168，195，239。

图1 空白血液(A)，空白血液加入速可眠的色谱图(B)

图2 血液样品中速可眠的质谱图

2.2 线性范围和检出限

分别配制成含速可眠浓度为300、1000、2000、3000、5000ng/ml的系列标准溶液，按上述方法进行检测，以速可眠浓度为横坐标，峰面积为纵坐标制作标准曲线(如图3)，得到线性回归方程Y=295.9X－77533.1，相关系数为0.9907。结果表明血液中EtG浓度在300～5000ng/ml范围内呈良好的线性关系，以信噪比(S/N)等于3计算方法的检出限(LOD)，本方法的检出限为30ng/ml。

图3 速可眠的标准曲线

2.3 精密度和添加回收率

分别向空白血液中添加3个质量浓度的速可眠标准工作液，加标水平分别为 400、1000、4000ng/ml，按照本文建立的方法进行测定，每个添加水平作5份平行测定，连续测定5d，计算方法回收率和精密度，结果见表1。

表1 血液中EtG的添加回收率和精密度(n=5)

2.4 案例应用

对一中毒昏迷患者的血液，按本研究的方法检测速可眠的含量，浓度为12.8μg/ml，超过中毒浓度，表明患者服用过量速可眠，说明该方法完全可以满足临床检验中速可眠检测的要求。

3 讨论

本实验建立了测定人血液中速可眠的气相色谱－质谱方法，该方法样品前处理简单方便、灵敏度高、具有较好的回收率和精密度，分析成本低，为快速检测血液样品中的速可眠提供了一种可靠而有效的手段，在临床检验和法医学鉴定等领域中具有重要意义。

［1］López－Muňoz F，Ucha－Udabe R，Alamo C，et al.The history of barbiturates a century after their clinical introduction［J］.Neuropsychiatr Dis Treat，2005，1:329

［2］Johns MW.Self－poisoning with barbiturates in England and Wales during 1959－74［J］.Br Med J，1977，1:1128

［3］胡绪英，罗毅，冯建林，等.生物样品中速可眠及代谢产物的分析［J］.色谱，1995，13(3):178

［4］Li S，Weber SG.Determination of barbiturates by solidphase microextraction and capillary electrophoresis［J］.Anal Chem，1997，69:1217

［5］Coudort F，lazard JM，Paire M，et al.Rapid Toxicological screening of barbiturates in plasma by wide－bore capillary gas chr－omatography and nitrogen－phosphorus detection［J］.J Anal Toxicol，1993，17:109

［6］Kabra PM，Stafford BE，Marton LJ.Rapid method for screening toxic drugs in serum with liquid chromatography［J］.J Anal Toxicol，1981，5:177

［7］Feng J，Wang L，Dai I，et al.Simultaneous determination of multiple drugs of abuse and relevant metabolites in urine by LC－MS－MS［J］.J Anal Toxicol，2007，31(7):359

［8］Yu JT，Bisceglia KJ，Bouwer EJ，et al.Determination of pharmaceuticals and antiseptics in water by solid－phase extraction and gas chromatography/mass spectrometry:analysis via pentafluorobenzylation and stable isotope dilution［J］.Anal Bioanal Chem，2012，403:583