张建军 王博 田元 张景辉 吴河水

·论著·

TLR4 shRNA质粒的构建及稳定转染人胰腺癌PANC1细胞株的筛选

张建军 王博 田元 张景辉 吴河水

目的构建靶向人TLR4基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒，转染胰腺癌细胞，并筛选出稳定转染的克隆细胞株。方法采用小分子干扰RNA(siRNA)软件设计3个靶向TLR4基因的shRNA，构建3个质粒表达载体，分别命名为TLR4-1、TLR4-2、TLR4-3；选取抑制效率最高的shRNA质粒，采用脂质体法转染胰腺癌PANC1细胞；实时定量PCR和流式细胞技术检测细胞TLR4 shRNA基因沉默效率和转染效率；G418抗性筛选和有限稀释单克隆形成法挑选培育稳定转染TLR4 shRNA的单克隆细胞系。结果转染48 h后PANC1细胞瞬时转染效率为(46.72±5.06)%。转染TLR4-1、TLR4-2、TLR4-3的细胞的TLR4 mRNA表达水平分别为0.025±0.004、0.027±0.003、0.019±0.006，均显著低于未转染组的0.061±0.018和阴性对照转染组的0.057±0.015(P值均<0.05)。以沉默效果最佳的TLR4-3转染细胞所获得的稳转细胞的转染效率为(82.79±8.16)%，较瞬转细胞显著提高(P=0.001)；TLR4 mRNA表达水平为0.010±0.002,较瞬转细胞显著下调(P=0.001)；TLR4蛋白表达率为(0.54±0.32)%，显著低于未转染细胞的(87.42±5.00)%和转染阴性对照细胞的(82.90±5.00)%(P=0.000)。结论成功筛选到TLR4基因沉默的稳转PANC1细胞。

胰腺肿瘤； Toll样受体4； 转染； RNA干扰

Toll样受体4(Toll like receptor 4，TLR4)主要表达于上皮细胞和免疫细胞，在宿主防御反应中起着重要作用[1]。近年来发现，TLR4在很多肿瘤细胞和肿瘤组织中表达上调[2]。我们曾报道TLR4在胰腺癌中高表达，且与肿瘤大小、淋巴结转移、血管侵犯及临床分期相关[3]。因此，TLR4可能成为治疗胰腺癌的新靶点。本研究应用RNA干扰(RNAi)技术构建靶向TLR4的质粒，转染人胰腺癌PANC1细胞，筛选稳转细胞克隆。

材料和方法

一、靶向TLR4表达质粒的构建

用siRNA WizardTMInvivogen软件设计3个靶向人TLR4基因cDNA序列的短发夹RNA(shRNA)，并应用在线软件BLAST检索数据库排除其他基因的同源性序列，其顺序为 BamH酶切位点、19 nt正义序列、9 nt loop接头序列、19 nt反义序列、 12 nt RNA聚合酶终止子(6个T)、Hind酶切位点，分别命名为TLR4-1、TLR4-2和TLR4-3(表1)。携带绿色荧光蛋白(GFP)的TLR4 shRNA 表达质粒由上海吉凯基因公司构建，并经测序证实。……