邓龙祥 陈况 叶初阳 王黎平 刘芳娥

睡眠具有维持个体生存、恢复体力及精力、促进生长发育、易化学习等功能。近年来的研究表明，不同程度的睡眠剥夺可引起机体免疫力下降、警觉性和判断力下降、记忆力下降等变化［1］。L-苹果酸是一种重要的天然有机酸，广泛分布于植物、动物与微生物细胞中，其口感接近天然苹果的酸味［2］。有研究证明L-苹果酸可以改善脑组织的能量代谢，调整脑内神经递质，有利于学习记忆功能的恢复，对学习记忆有明显的改善作用［3］。但L-苹果酸对睡眠剥夺后大鼠学习和记忆能力的影响尚未见报道。本实验拟通过研究L-苹果酸对睡眠剥夺后大鼠学习记忆的影响，为L-苹果酸影响学习记忆这一理论提供更加全面的依据。

1 资料和方法

1.1 实验动物和分组 选用健康成年雄性SD大鼠20只，体重(200±20)g(第四军医大学实验动物中心提供)。经Morris水迷宫训练之后，筛选出成绩相近的大鼠16只，随机分为2组，每组8只。对照组:SD+生理盐水组;实验组:SD+L-苹果酸组。

1.2 药品与仪器 睡眠剥夺装置(参照文献［4］自制)，Morris水迷宫(参照文献［5］自制)，秒表，L-苹果酸(药品源自上海源叶生物科技有限公司，纯度为99.9%)，灌胃针等。

1.3 给药 实验组每日给L-苹果酸的剂量为10 mg/kg，配置成2 ml的溶液，每天下午17:00灌胃，对照组在相同的时间内用相同量的生理盐水进行灌胃。1次/d，连续进行7 d，然后给予睡眠剥夺3 d。在睡眠剥夺期间，依然按分组每日给予L-苹果酸或着生理盐水。

1.4 睡眠剥夺模型的建立 采用多平台水环境法(modifield multiple platform method)制备大鼠睡眠剥夺模型。使用90 cm×30 cm×30 cm的鼠箱，其中有一高15 cm，直径6.3 cm的平台。在平台的周围注满水，水温保持在20℃左右，水面距平台面约1.0 cm。鼠在平台上可以自行进食饮水。若其睡眠，则由于肌肉张力松弛而落入水中，大鼠只能重新振作精神爬上平台，如此反复达到睡眠剥夺的效果。睡眠剥夺之前，先让大鼠适应环境，时间为7 d，此期间在给予大鼠L-苹果酸和生理盐水灌胃的同时，将大鼠放在未注水的睡眠剥夺箱内，让其熟悉环境。在7 d的熟悉环境之后，即进行72 h的睡眠剥夺。

1.5 学习记忆的测试 用Morris水迷宫法进行大鼠学习记忆的训练与测试。水迷宫为一直径1m，高50 cm的圆形水池，池内水深25 cm，水池按方位平均分为四个象限，设定4个入水点。在一个象限内置一高24 cm的平台，平台没于水而下1 cm。水温保持在20℃左右，平台、水、池壁均染成白色以隐蔽平台。实验过程中水池及周围环境保持不变。睡眠剥夺前对大鼠进行水迷宫学习训练。训练时，将大鼠面向池壁从四个入水点分别放入水池，用秒表记录大鼠的反应时，即大鼠从入水到找到水下隐蔽平台并站立于其上所需的时间，用秒(s)表示。大鼠找到平台后，让其在平台上站立10 s，然后进行下一次的训练。每只大鼠从四个入水点分别放入水池为一轮训练，训练4轮，即训练16次，每次间隔60 s，两次训练之间间隔30 s。训练成功的标志是连续4次都是60 s内找到平台并站立于其上。淘汰训练未成功的大鼠，本实验16只大鼠训练成功，淘汰4只。在睡眠剥夺40h和72 h各进行水迷宫测量一次。测量时，将大鼠面向池壁从4个入水点分别放入的反应时(s)取平均数，作为测试成绩，若大鼠在60 s内未找到平台，则以60 s计。

2 结果

将实验组和对照组大鼠在水迷宫中的反应时数据进行单因素方差分析，SD48 h和SD72 h的差异都具有统计学显著性(见表1)。均数间的多重比较显示，无论SD48 h还是SD72 h，实验组的大鼠反应时均较对照组明显缩短(P＜0.01)。

表1 各组睡眠剥夺大鼠在水迷宫中的反应时(±s，n=8)

表1 各组睡眠剥夺大鼠在水迷宫中的反应时(±s，n=8)

注:实验组与对照组相比P＜0.05，实验数据有意义

时间 对照组 实验组48 h 27.94±8.07 14.93±3.89 72 h 27.32±4.30 14.71±4.75

3 讨论

已有研究表明，睡眠和记忆有密切关系［6］，睡眠剥夺对动物的短时和长时记忆、记忆的保持和巩固都有影响。鉴于睡眠剥夺对记忆的影响已有大量的实验证明，所以本实验在设计时，未设正常对照组，即肯定了睡眠剥夺对记忆的不良作用。本实验中Morris水迷宫法进行大鼠学习记忆的测试显示，进行L-苹果酸灌胃组的大鼠在同样的睡眠剥夺条件下学习记忆能力明显强于生理盐水组，即L-苹果酸对睡眠剥夺大鼠的学习记忆能力具有明显的改善作用，进一步完善了L-苹果酸可以改善脑组织的能量代谢，调整脑内神经递质，有利于学习记忆功能的恢复，对学习记忆有明显的改善作用［5］这一论断。从实验结果SD48 h比SD72 h反应时长，原因可能是Morris水迷宫训练是在睡眠剥夺之前进行的，相隔2 d进行SD48 h记忆测试，再隔一天进行SD72 h记忆测试，前者比后者相隔时间长，遗忘较多。也就是说进行48 h记忆测试相当于又对大鼠进行了一次水迷宫学习记忆训练，所以睡眠剥夺72 h比48 h反应时短。L-苹果酸对于睡眠剥夺后学习记忆功能的影响为进行夜间作业的人员的保健具有重要意义，为寻找合适的保健药物提供了一条新的思路。

［1］Corsi CM，Arce C，Del Rio Portilla IY，et al.Amplitud reduction in visual event related potentials as a function of sleep deprivation.Sleep，1999，22(1):181.

［2］吴清平，周小燕.L-苹果酸研究进展.微生物学通报，1990，17(1):30-33.

［3］周红宇郑国统张士善.谷氨酸脱羧酶抑制剂L-苹果酸对小鼠学习记忆的影响.药学学报，1996，31(12):897-900.

［4］Sucheki D，Palma BD，Tufik S.Sleep rebound in animals deprived of paradoxical sleep by the modified multiple platform method.Brain Res，2000，875:14222.

［5］Morris R.Development of a water maze procedure for studying spacial learning in the rat.Neurosci Methods，1984，11:47.

［6］Bueno OFA，Lobo LL，Olivedra MGM，et al，Dissociated paradoxical sleep deprivation effects on inhibiting avoidance and conditioned fear.Physiol Behav，1994，56(4):775-779.