苏 妮 孙振师 张化恒 （山东省莱西市畜牧兽医局 266600）

奶牛早期妊娠诊断是提高奶牛繁殖率和产奶量的重要措施，具有很高的经济价值。最早应用的早孕诊断方法是直肠检查法，但此法确诊时间晚，劳动强度大，诊断准确率受技术水平和操作状态的影响大，且诊断过程易对胚胎造成危害。所以自70年代开始，国内外进行了大量的实验室早孕诊断方法的研究，如放射免疫法、酶联免疫吸附法、免疫乳胶凝集抑制试验等，但这些诊断早孕的方法目前仍处于进一步研究阶段。为了探讨适合广大基层单位奶牛早孕诊断的方法，笔者对184头配种后21～26d的奶牛分别用RIA.、ELISA、LAIT法进行了早孕诊断的对比试验研究。

1 材料与方法

1.1 试验动物及采样

1.1.1 试验动物 选择发情配种后21～26d的黑白花奶牛184头。

1.1.2 奶样采集 取每头奶牛上午挤的混合奶为奶样，其中一部分脱脂后作RIA法测定。

1.1.3 脱激素乳的制备 取20ml乳样加2.0g活性炭，磁力搅拌器搅拌30min，置冰箱内过夜，2000r/min离心1h，取上清液同法每离心1次收集上清液即为去激素率98%的脱激素乳，用于ELISA法测定。

1.1.4 尿样采集 取非晨时自然排出的尿液，用作LAIT的测定尿样。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 RIA法的试剂与仪器 抗血清是以孕酮-11a-半琥珀酸盐-RSA所免疫的家兔制备的，孕酮放射免疫药盒由中国科学院动物研究所提供。

1.2.2 ELISA法试剂与仪器 抗血清同RIA法制备，辣根过氧化物酶（HRP.R2≈3.0），牛血清白蛋白，氯甲酸异丁酯，3，3′5，5′-四甲基苯胺（TMB），CP等。40孔ELISA微量测定板，S-ELISA-833型酶标测定仪。酶结合物按Dawsow（1978）和Munro（1984）的混合酸酐法合成的孕酮-辣根过氧化物酶（P-11-HRP）。工作液按石放雄的方法制备。

1.2.3 LAIT法的试剂与仪器 免疫乳胶凝集抑制妊娠诊断试剂为卫生部兰州生物制品研究所提供。

1.3 测定方法

1.3.1 RIA法 以Heap（1976）奶中孕酮分析法和中国科学院动物研究所的血浆孕酮分析法的操作程序进行，孕酮标准曲线按Log-dose法在半对数纸上制作。测定范围为0～800pg。

1.3.2 ELISA法 按石放雄（1987）操作程序，首先制作0～1000pg的典型孕酮浓度-光密度标准曲线和孕酮浓度-结合率标准曲线，然后同法进行乳样测定，在酶标定量仪上读取440um下的光密度。

1.3.3 LAIT法 在清洁的载玻片上，加1滴待测尿样，充分拌匀3min，在显微镜下（100×）观察凝集抑制反应。

1.4 判定标准及准确率的检测

1.4.1 各测定方法的判定标准 RIA与ELISA法的判定标准为21～26d奶中孕酮含量＞4.0ng/ml为阳性（怀孕）；奶中孕酮＜2.0ng/ml为阴性（未孕）；LIAT法判定标准：若出现均匀一致的凝集颗粒为阴性（空孕）；不出现凝集颗粒为阳性（孕牛）。

1.4.2 各测定方法准确率的检测 根据对不同妊娠的直检诊断结果和配种、产犊记录资料进行准确率的检测。

2 结果与分析

2.1 不同早孕诊断方法的准确率

对配种后21～26d的184头奶牛用RIA法诊断了51头，用ELISA法诊断了55头，用LAIT诊断了78头，结果表明（表1）：RIA法与ELISA法对奶牛早孕诊断的准确率基本一致，而LAIT法早孕诊断的准确率明显高于RIA与ELISA法。

表1 3种早孕诊断方法准确率的比较

2.2 3种早孕诊断方法应用价值分析

RIA与ELISA法其灵敏性基本一致 ，LAIT法灵敏性较高；RIA法每日可测150份奶样，ELISA法每日可测200份奶样，LAIT法每日可测400头尿样，所以LAIT法工作效率较高；RIA法与ELISA法操作复杂，所需试剂、仪器昂贵，而 LAIT法操作简单，所用试剂、仪器简单便宜。

3 小结与讨论

（1）通过用RIA法、ELISA法和LAIT法分别对51头、55头、和78头奶牛进行的早孕诊断比较，诊断准确率以LIAT法最高，达92.31%，比RIA法 与ELISA法分别提高8%和6.85%。（2）LIAT法和RIA法与ELISA法诊断的灵敏性高，操作简单，容易掌握，工作效率高，且可现场测定，因此是基层生产单位值得大力推广的奶牛早孕诊断方法。