顾冬花

（青海大通县桦林乡兽医站 810100）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，简称Vp）是一种革兰氏阴性嗜盐菌（Halophilic bacteria），最早是由Fujino等于1953年从日本一个食物中毒患者初次分离得到。该菌为海洋性生物寄生菌，主要分布于近海岸的海水、海底沉积物及鱼、贝类、海带及虾等海洋生物中。Vp是食用海产品引起腹泻、呕吐和发烧等肠胃炎的主要致病菌之一，也是近年来世界范围内由Vp感染引发食物中毒趋于严重的食源性公共卫生问题之一。由Vp引起的食物中毒占日本食物中毒病例数的20%～30%[1]。在欧洲和北美地区也曾多次暴发过Vp食物中毒事件[2]。根据我国的食源性疾病监测网数据显示，Vp中毒的发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势，均超过沙门氏菌食物中毒而跃居于微生物食源性疾病爆发的首位[3，4]，特别是在一些沿海城市，由该菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒总数的比例高达60%以上[5-7]。由于本地销售的仔虾等海产品均为外省调入，在包装或运输过程中污染Vp的机率可能增加，为了初步摸清Vp在本地市售仔虾中的带菌率，提高相关检疫机构对Vp的重视程度，降低食源性疾病的风险，2009年3～7月笔者对随机采集于西宁市某几个农贸市场的70份仔虾样品进行了常规病原分离。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 随机采取西宁市几个农贸市场市售仔虾70份，（10只/份），置4℃冰箱备用。

1.1.2 氧化酶试剂 1%盐酸二甲基对苯二胺溶液（用前配制）、1%α萘酚-乙醇溶液。

1.1.3 培养基 3%氯化钠碱性蛋白胨水、硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐、蔗糖琼脂（TCBS）平板，嗜盐菌选择性平板，氯化钠蔗糖琼脂平板，SS平板，3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，3%氯化钠三糖铁（TSI）琼脂斜面，0%、3%、6%、8%、11%NaCl胰胨水及各种生化培养基均由青海大学农牧学院动物医学系传染病实验室自制。

1.1.4 试验动物 健康昆明系小白鼠5只（14～16g）均购于青海地方病研究所。

1.2 方法

1.2.1 样品的制备 无菌剥去虾壳后称取25g（含内脏和肉）置于灭菌研钵中，用灭菌剪刀充分剪碎后研磨，分装于500ml灭菌三角瓶中，再加入225ml 3%氯化钠碱性蛋白胨水充分振荡10min，使其成为1∶10稀释液，再用1ml灭菌吸管吸取1∶10稀释液1ml作10倍递增稀释，制成1∶100和1∶1000稀释液。

1.2.2 增菌 分别用1ml灭菌吸管吸取上述3个稀释液（1∶10、1∶100、1∶1000）各1ml，接种于装有9ml 3%氯化钠碱性蛋白胨水的灭菌试管中，每一稀释度接种3管，37℃增菌振荡培养8～16h。

1.2.3 分离培养 分别勾取上述变混浊的增菌液1～2环，划线接种于氯化钠蔗糖琼脂平板、嗜盐菌选择性平板和SS平板，于37℃培养18～36h。观察菌落形态并分别勾取1/3疑似菌落涂片进行革兰氏染色、镜检。

1.2.4 细菌纯化培养 分别挑取TCBS平板上的3个疑似菌落于3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上进行纯化培养，置4℃冰箱备用。

1.2.5 初筛试验 （1）细胞色素氧化酶试验。分别挑取纯培养的单个菌落涂布于洁净的滤纸条上，然后滴加1%盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者再滴加1%α萘酚-乙醇溶液一滴，判定结果。（2）3%氯化钠三糖铁试验。分别挑取纯培养的单个菌落接种于3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，37℃培养18～24h，观察结果。（3）嗜盐性试验。分别挑取纯培养的单个菌落依次接种于0%NaCl胰胨水、3%NaCl胰胨水、6%NaCl胰胨水、8%NaCl胰胨水和11%NaCl胰胨水中，37℃恒温培养24～48h后，观察结果。

1.2.6 生化试验 分别勾取初筛试验阳性的疑似Vp接种于葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、蕈糖、靛基质、甲基红、硝酸盐、乳糖、蔗糖、肌醇、水杨苷、V-P、硫化氢、尿素酶、鼠李糖和棉子糖培养基中，37℃恒温培养24～48h，观察结果。

1.2.7 致病性试验 将符合Vp生化结果的菌株分别接种于3%氯化钠三糖铁斜面上，37℃培养18～24h后用灭菌生理盐水无菌洗下并与麦氏比浊管进行比浊，均选取3×108浓度的菌悬液分别腹腔注射小白鼠各1只，0.5ml/只，同时用生理盐水腹腔注射小白鼠1只作对照。

2 结果

2.1 菌落形态及培养特性

在嗜盐菌选择性平板上为小圆形、边缘整齐的浅黄色菌落，经过2～3次传代纯培养后均变成均匀的小菌落，呈黄色，菌落光滑湿润、隆起， 直径为0.2～1mm，中心稍混浊；在氯化钠蔗糖琼脂平板上为圆形菌落，直径2～3mm，半透明或不透明，没有粘性；在SS琼脂平板上出现了圆形、扁平、边缘整齐、光滑湿润、蜡滴状的粘韧性菌落1～2mm；在TCBS平板上有4个副溶血性弧菌可疑蓝绿色菌落生长，菌落形态均为圆形、边缘整齐、湿润、稍混浊、半透明，直径2～4mm。

2.2 涂片、染色及镜检

挑取可疑菌落涂片、革兰氏染色镜检可见到两端浓染，呈棒状、弧状或卵圆状多形态的革兰氏阴性菌。

2.3 初筛试验

2.3.1 细胞色素氧化酶 滴加1%盐酸二甲基对苯二胺溶液变成粉红色，再滴加1%α萘酚-乙醇溶液变成蓝色，细胞色素氧化酶试验阳性。

2.3.2 3%氯化钠三糖铁 底层变黄、斜面变红、不产气、不产硫化氢。

2.3.3 嗜盐性 在3%、6%和8%氯化钠胰胨水中生长良好，0%和11%氯化钠胰胨水中不生长。

2.4 生化鉴定

结果详见附表。

附表 副溶血性弧菌生化反应结果表

2.5 致病性试验

4只小白鼠36～72h内死亡，对照组小白鼠饲喂1周仍健活。采取脏器进行细菌分离，获得与原分离菌株一致的小杆菌，试验结果表明分离菌具有较强的致病性。

3 讨论

（1）在70份仔虾中共分离出4株疑似Vp菌株，经细菌菌落形态及培养特性观察、细胞色素氧化酶试验、嗜盐性试验和生化试验等证实分离出的4株细菌均为Vp。增菌培养阳性管数为（1，0，0），应用3管法查SN 0173-92出口食品副溶血性弧菌检验方法的MPN表，结果每100g仔虾中Vp 的MPN值为360。（2）此次检测结果显示，西宁市市售仔虾中存在Vp污染，致病性试验也表明分离菌对小白鼠有致死效应，食用该产品存在安全隐患。由于本市市场销售的海产品种类比较单一，且大多为冷冻包装或活体长途运输过来的海产品，新鲜度与其产区相比有所降低，而长途运输和调运海产品的中间环节也可能增加污染Vp的风险，应该引起相关检疫部门和广大消费者的注意。（3）Vp是近几年来越来越受到重视的一种海产品食物中毒菌，在很多国家都有Vp食物中毒发生，以日本及我国沿海地区发病率最高。Vp引起中毒的主要症状是呕吐、水样腹泻或血便，甚至败血症、皮肤大疱性损害、反应性关节炎和类风湿性关节炎[8]；典型症状是腹部或脐周呈现阵发性腹绞痛，水样腹泻后出现脓血便，同时伴有恶心、呕吐，体温在38～39℃，个别患者可达40℃以上，甚至发生休克、昏迷，若抢救不及时可造成死亡[9]。因其致病性强，其发病急，传播快，感染源多，在人群中流行的持续时间长，属国际上检疫传染病之一。因此在食用各类海产品时一定要注意对该菌的卫生防范，严把海产品生产、加工、包装和运输的质量关，避免交叉污染，避免Vp引起食物中毒的发生。在食用海产品时要做到低温贮藏，加工过程中要煮熟、煮透，切生、熟食物的厨具要分开，用完后进行严格的消毒处理。同时生、熟食物应分开放置，避免造成交叉污染。