张 晨，许赣荣，严新龙

（1.江南大学生物工程学院，江苏无锡 214122；

2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 214122；

3.江苏太仓海烟烟草薄片有限公司，江苏苏州 215400)

利用酿酒酵母改进烟草萃取液的香气特性

张 晨1，2，许赣荣1，*，严新龙3

（1.江南大学生物工程学院，江苏无锡 214122；

2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 214122；

3.江苏太仓海烟烟草薄片有限公司，江苏苏州 215400)

利用酿酒酵母对造纸法再造烟叶生产过程中的烟草萃取液进行了转化增香处理，应用SPME-GC-MS技术对处理前后烟草萃取液中的挥发性致香成分进行了分析比较并且用处理前后的烟草萃取液分别涂布于烟草薄片片基上，并对这两种片基进行了评吸比较，结果表明，未处理的烟草萃取液中检测出48种挥发性致香成分，而处理后的烟草萃取液中共检测出83种挥发性致香物质；经过酿酒酵母处理后，酸类、酮类、酯类、烯烃类等致香物质均有不同程度的增加，增香效果明显，能够改善烟草薄片的吸食品质。

再造烟叶，烟草萃取液，酿酒酵母，致香成分

造纸法烟草薄片制备过程中利用烟草原料用水萃取、多效浓缩制备得到烟草萃取浓缩液[1-2]。而这种制造工艺在很大程度上只是原材料的物理性质的改变，原料的固有化学性质并未完全改变，燃吸时仍存在木质气较重、辛辣灼热感较明显、余味差等质量缺陷。烟草中酸性香气物质能够改善烟草酸碱度，赋予烟气味和芳香特征，使烟气柔和、适口[3]。中性香气成分常用其含量多少来衡量烟叶香气的强弱。烟草中主要的中性香气物质有β-大马酮、3-庚酮、茄酮、新植二烯等。碱性香气物质包括烟碱、吡咯、呋喃等[4-6]。程昌合等[7]将烟草萃取浓缩液在45℃醇化处理数日，作者认为经过醇化处理后烟末浓缩液中的挥发性组分增多，且主要致香成分含量均有不同程度的增加。处理后烟草薄片的香气量、谐调性、木质杂气和余味等方面有较明显地改善。据此认为，浓缩液醇化处理是提高烟草薄片吸食品质和使用价值的有效途径。但究竟是何种微生物在醇化过程中所起的作用包括有增加香气成分的作用，论文并未给出明确的结论。我们认为醇化过程中烟草萃取浓缩液浓度较高，微生物浓度较低，微生物的作用对萃取液的影响可能相对较弱。醇化作用很大程度上是由于温度效应所导致的浓缩液中各种物质所发生化学反应。而且如此长时间的醇化处理，明显增加设备投资。为了进一步改善造纸法薄片的内在品质，对其中的烟草萃取液进行发酵增香处理也是一种值得探索的工艺路线。酸类、醇类、羰基类、酯类等各种香味化合物，或者其前体物和中间产物，具有增加香气的效果。这些物质可通过微生物对烟叶或烟草萃取液的发酵转化作用而产生。本文重点研究在烟草萃取浓缩液中外加酿酒酵母进行快速转化增香以提高萃取液中致香成分的含量。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酿酒酵母 本实验室保存菌种；烟草萃取液 由太仓海烟烟草薄片有限公司提供；烟草萃取液 利用烟梗、烟梗粉末和碎烟叶按照一定的配料比，在65～75℃的温度下两相逆流萃取20min，自然过滤，再经过两效浓缩最终获得（可溶性固形物含量约为40%）。

Agilent－1200型高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；1200LGC/MS－MS气相色谱－串联质谱联用仪 美国瓦里安公司；Carbomix H－NP色谱柱 美国赛分科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 烟草萃取液的转化增香 量取400mL可溶性固形物含量为30%的烟草萃取液，进行巴氏灭菌（70℃保持30min），置于悬浮细胞转化增香实验装置中，称取6g酿酒酵母添加至烟草萃取液中，进行微生物转化。转化温度为30℃，转化时间为4h。细胞自然沉降后，倒出增香后发酵液体并收集沉降酵母菌体。

1.2.2 酵母干重的测定 取一定量的酵母湿菌体，利用水分测定仪测定其水分含量，计算酵母干重。

1.2.3 还原糖和可溶性总糖的测定

1.2.3.1 标准曲线的绘制 分别量取0.5mg/mL葡萄糖标准溶液0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.0mL，置于具塞25mL试管中，吸取蒸馏水分别补充至2.0mL，再各加2.0mL DNS试剂。盖上塞子，置于沸水浴中加热6min，取出，用流动冷水冷却后用蒸馏水定容到刻度25mL，充分摇匀，静置10min后，在紫外可见分光光度计上于540nm波长下，以空白（即量取葡萄糖标准溶液0mL）为参比液，测其吸光度。经回归统计求出其回归方程。

1.2.3.2 测定还原糖与总糖 还原糖待测液：取适量烟草萃取液于250mL容量瓶中定容，即为还原糖待测液。

水溶性总糖的提取。吸取还原糖待测液25mL于250mL三角瓶中，并加入1∶3（浓盐酸与蒸馏水体积比）的盐酸溶液7mL，置于沸水浴中酸化0.5h，加1～2滴甲基红指示剂，用10%NaOH调至中性或偏碱性（pH7.0～7.5），转移到100mL容量瓶并定容，即为水溶性总糖待测液。

分别取还原糖待测液2.00mL，水溶性总糖待测液2.00mL，加入3，5－二硝基水杨酸显色剂2.00mL，按标准液的处理方法测定吸光度，然后从标准曲线上查出对应的浓度并计算总糖含量。

1.2.4 SPME－GC－MS检测方法 SPME分析条件：取10mL烟草萃取液，置于顶空瓶中，采用75μm CAR/ PDMS萃取头，样品预热5min，50℃萃取30min。取出萃取头，并立即插入GC/MS仪进样口（温度250℃）中解吸7min，进行GC/MS分析。

GC/MS分析条件：色谱柱：DB－Wax 30m×0.25mm× 0.25μm；进样口温度：250℃；程序升温：初温40℃，保持3min，以8℃/min升至120℃，再以10℃/min升至230℃，保持8min；载气：He，流量1mL/min；进样量：1.0μL；El离子源温度：200℃；电离能量：70eV；倍增器电压：1000V；扫描范围：33～450amu。

1.2.5 评吸方法 将处理前后的烟草萃取液涂布在烟草片基上，快速烘干，置于恒温恒湿室中，维持烟草薄片湿度在12%左右，分别卷至成10支单料烟，由10人专业评吸组分别对香气、杂气、木质气、刺激性、灼烧感、余味和异味七个指标进行评吸。

2 结果与分析

2.1 微生物转化烟草萃取液基本工艺条件的确定

2.1.1 微生物菌种的选择 本文选择酵母菌，是因为酵母菌是安全的食用菌，其次酵母菌有较强的产生风味物质进而增香的作用。先选择了实验室保存的几株酵母菌种进行发酵实验。发现酵母菌也可以利用较高浓度烟草萃取液进行生长。初步发酵实验结果发现一株酿酒酵母效果较好，容易产生多种酯类、酸类和酮类等致香成分，发酵后的萃取液含有酒香气味且不易染菌。

2.1.2 酿酒酵母菌液态转化烟草萃取液基本条件的确定

2.1.2.1 烟草萃取液可溶性固形物含量的确定 由于采用低可溶性固形物浓度的烟草萃取液进行酵母菌的转化发酵，之后需要利用高能耗的浓缩设备进行萃取液浓缩，考虑生产成本问题，设计实验烟草萃取液浓度为30%和40%。酿酒酵母接入量为6g/L烟草萃取液，于150r/min、30℃摇床上恒温培养24h，测定酵母菌体重量。

图1 烟草萃取液可溶性固形物含量对酿酒酵母生长的影响Fig.1 Effect of tobacco extracts soluble solid content on saccharomyces cerevisiae growth

由图1可知，烟草萃取液可溶性固形物含量过高，会抑制酿酒酵母的生长，烟草萃取液可溶性固形物含量为30%情况下，酿酒酵母的生长明显要好于可溶性固形物含量为40%的情况。故酿酒酵母进行烟草萃取液转化发酵的最佳浓度选择30%较为合适。

1.2.2.2 酿酒酵母添加量的确定 确定最佳烟草萃取液可溶性固形物含量之后，酿酒酵母接入量设定为6、15、30、45、60（干酵母菌g/L烟草萃取液），转化发酵4h后，检测转化增香液糖类物质含量。

由图2能够看出随着酵母接入量的增加，烟草萃取液中还原糖和总糖逐渐降低，但是接入量大于15g/mL烟草萃取液时，糖类物质含量下降趋势呈现较缓趋势，并且在接入量为15g/mL烟草萃取液时糖碱比（1.08∶1）也接近较适范围（1.02∶1～1.05∶1）。

图2 酿酒酵母接入量对糖类物质变化影响Fig.2 Effect of saccharomyces cerevisiae inoculum size on the contents of saccharides

综上所述，酿酒酵母接入量选择15g/mL烟草萃取液较为合适。

1.2.2.3 酿酒酵母对烟草萃取液转化时间的确定 确定最佳烟草萃取液可溶性固形物含量和酿酒酵母接入量之后，酿酒酵母转化烟草萃取液的时间设为1、

2、3、4、5、6h，检测转化后烟草萃取液的糖类物质含量。

图3 酿酒酵母转化时间对烟草萃取液糖类物质含量的影响Fig.3 Effect of saccharomyces cerevisiae fermentation time on the contents of saccharides

由图3可以看出，随着酿酒酵母转化时间的增加，烟草萃取液中还原糖和总糖含量逐渐下降，这可能是由于酿酒酵母利用转化了糖类物质。从图3中看出，在酿酒酵母转化时间在4h以上糖类物质含量下降趋于平缓，可能是由于转化时间过长，酵母生长处于平稳期或者衰亡期。

综上所述，综合考虑产品运转周期和生产成本问题，酿酒酵母对烟草萃取液转化时间选择4h时较为合适。

2.2 烟草萃取液微生物发酵前后香气成分的比较

在2.1节所述的最适条件下进行酿酒酵母转化增香烟草萃取液实验。利用顶空固相微萃取法（SPME）分别富集烟草萃取液和经过酿酒酵母转化增香的烟草萃取液中的挥发性成分，采用GC/MS法对萃取头收集的气体成分进行分析，经谱库检索，经酿酒酵母转化增香的烟草萃取液共鉴定出83种化学成分，而未处理的烟草萃取液只检测出48种成分，分析结果见图4、图5所示。

2.2.1 酸类物质含量比较分析 酿酒酵母处理后的烟草萃取液经过GC/MS分析得出酸类物质有9种，主要致香成分有6种，未处理的烟草萃取液中所含酸性有效致香成分仅有2种，而经过处理的烟草萃取液酸类物质致香成分增加至6种，较未处理的烟草萃取液主要增加了3－甲基丁酸（0.473%）、辛酸（0.498%）等酸类致香成分，如表1所示。

图4 未处理烟草萃取液挥发性成分的气相色谱－质谱总离子图Fig.4 GC－MS total ionic chromatogram of volatiles in untreated tobacco extract

图5 酿酒酵母处理后烟草萃取液挥发性成分的气相色谱－质谱总离子图Fig.5 GC－MS total ionic chromatogram of volatiles in tobacco extract

表1 处理前后烟草萃取液中酸类致香成分比较Table 1 The comparison of the acids between tobacco extract and control

2.2.2 酯类物质含量比较分析 酯类致香物质是主要的香味物质，对烟草萃取液的气味起到很重要的作用。经过GC/MS分析得出处理后的烟草萃取液含酯类物质有10种，如表2所示。未处理的烟草萃取液中主要的酯类致香成分只有乙酸乙酯和丁内酯，含量分别只有4.108%和1.705%，而经过酿酒酵母处理后的烟草萃取液酯类物质种类增加至10种，总量达14.199%。经酿酒酵母发酵后的烟草萃取液中主要增加了乙酸乙酯（8.853%）、辛酸乙酯（2.343%）、癸酸乙酯（1.097%）等酯类成分。

2.2.3 醇类物质含量比较分析 醇类物质是烟草萃取液中重要的挥发性物质。处理后烟草萃取液经过GC/MS分析得出醇类致香物质有16种，如表3所示。未处理的烟草萃取液醇类致香物质种类有9种，总量达11.492%，而酿酒酵母处理后的烟草萃取液醇类致香物质种类有16种，总量达52.712%，较未处理的烟草萃取液，增加的主要醇类致香物质有乙醇（24.021%）、异丁醇（2.959%）、异戊醇（20.284%）、芳樟醇（0.812%）、苯乙醇（2.463%）等。

表2 处理前后烟草萃取液中酯类致香成分比较Table 2 The comparison of the esters in tobacco extract

2.2.4 酮类物质含量比较分析 据研究发现，中性香气成分是影响烟叶的重要化学成分，研究者常用其含量多少来衡量烟叶香气的强弱。烟草中主要的中性香气物质有β－紫罗兰酮、β－大马酮、茄酮、巨豆三烯酮、香叶基丙酮等[8]。酮类物质是烟草萃取液中重要的香气物质。经过酿酒酵母转化发酵后的烟草萃取液酮类致香成分增加至13种，如表4所示。从主要酮类物质的种类和含量以及烟草萃取液中所有酮类物质和含量上看转化后的烟草萃取液香气（酮类物质总量为15.549%）要明显优于未处理的烟草萃取液（酮类物质总量为12.352%）。处理后的烟草萃取液较未处理的烟草萃取液增加了2，3－戊二酮（0.795%）、3－庚酮（0.303%）、α－紫罗兰酮（0.143%）等物质，茄酮含量增加至8.502%。

表4 处理前后烟草萃取液中酮类致香成分比较Table 4 The comparison of the ketones between tobacco extract and control

2.2.5 醛类物质含量比较分析 经过GC/MS分析得出处理后的烟草萃取液醛类物质有6种，如表5所示。处理前后的烟草萃取液醛类物质种类数增加了3种，分别是3－乙氧基丙醛（0.028%）、壬醛（0.026%）和2－吡咯甲醛（0.051%），但是醛类致香物质的含量总量下降，这是否为酿酒酵母转化过程中消耗所致，有待探讨。

表5 处理前后烟草萃取液中醛类致香成分比较Table 5 The comparison of the aldehydes between tobacco extract and control

2.2.6 烯烃和烯烃衍生物物质含量比较分析 未处理烟草萃取液中所含的烯烃和烯烃衍生物总量仅有0.18%，处理后的烟草萃取液经过GC/MS分析得出烯烃和烯烃衍生物物质有4种，如表6所示。较未处理的烟草萃取液主要增加了苯乙烯、新植二烯等致香成分，其中苯乙烯是有特殊香气的油状液体，对烟草香气清新愉悦有一定贡献。新植二烯在烟草燃烧时可直接进入烟气，这种萜烯类化合物本身具有一定的清香气[9]。

表7 处理前后的烟草萃取液涂布烟草片基吸食评价Table 7 The smoking evaluation of the tobacco sheet coated tobacco extract

表6 处理前后烟草萃取液中烯烃和烯烃衍生物致香成分比较Table 6 The comparison of the olefins and olefins derivatives in tobacco extract

2.3 评吸结果

由表7评吸结果可以看出，经过酿酒酵母转化后的烟草萃取液涂布烟草片基后，对其吸食品质有一定程度的改善，烟草片基中的余味、灼烧感等均明显降低，香气增加，产了令人较愉悦的香气。

3 结论

初步得出酿酒酵母处理烟草萃取液的基本工艺条件是：烟草萃取液的浓度为30%，酵母添加量为15g/L烟草萃取液，转化温度30℃，静置或搅拌转化时间为4h。如此短的时间处理，是因为酵母添加量较大。这对于快速处理烟草萃取液显然是有利的。

经处理后的烟草萃取液采用SPME和GC/MS对其中挥发性致香成分进行分析检测，共检测出83种成分，其中有6种酸，16种醇，13种酮，6种醛，10种酯，4种烯烃和烯烃衍生物。而未处理的烟草萃取液只检测出48种成分，其中有2种酸，9种醇，9种酮，4种醛，5种酯，1种烯烃和烯烃衍生物。处理后的烟草萃取液在酸类、醇类、酮类、酯类、烯烃和烯烃衍生物的种类和总量上均比未处理的烟草萃取液有所增加。

酿酒酵母处理对再造烟叶的烟气平衡作用明显，且增加了香味物质，处理后的再造烟叶烟气协调性更好，余味明显改善，并且含有香气成分。因此，酿酒酵母在烟草萃取液中的转化应用值得深入研究。

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Improve the aroma characteristics of the tobacco extracts by saccharomyces cerevisiae

ZHANG Chen1，2，XU Gan-rong1，*，YAN Xin-long3
（1.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；
2.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Taicang Tobacco Sheet Co.，Ltd.，Suzhou 215400，China）

In the preparation of reconstituted tobacco sheet by paper-making method，saccharomyces cerevisiae was used to ferment the concentrated tobacco extracts.The flavoring compositions of the fermented tobacco extracts analyzed by headspace solid-phase micro-extraction（HS-SPME）associated with capillary gas chromatography-mass-spectrometry（GC-MS），the results showed that：48 flavoring components were detected from unprocessed tobacco extract，and 83 flavoring components were detected from the treated tobacco extract.The contents of acids，ketones，esters，olefin and others after fermentation increased in various degrees，indicating that the flavoring effect was obvious after yeast fermentation of the extracts.The sensory quality of the reconstituted tobacco leaf which was coated with the fermented tobacco extracts was evaluated.The result indicated that the tobacco extract which treated by sacchaomyces cerevisiae could significantly improve smoking quality.

reconstituted tobacco leaf；tobacco extract；saccharomyces cerevisiae；flavoring components

TS44+4

B

1002-0306（2012）20-0137-05

2012－05－08 *通讯联系人

张晨（1988-），男，硕士研究生，研究方向：生物资源的开发与利用。