董 漪 陈 嬿 邬剑军 蒋雨平 董 强

肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）的病理特点是以脊髓运动神经元、脑干后组颅神经及锥体束受累为主。目前对于该病的发病机制及病因尚不明确，而血流灌注不足导致神经元退变是其中一种理论，临床研究发现运动神经元病变患者存在脊髓局部神经血流灌注不足［1］。由于正常组织发生缺氧时，组织可通过缺氧诱导因子（hypoxygen induced factor 1α，HIF-1α）与血管内皮生长 因 子 （Vascular endothelial growth factor，VEGF）基因启动子上的缺氧应答元件结合，使血清的VEGF水平反应性迅速上调［2］。因此，长期病理性的VEGF低水平可在引起血管退变之前就发生中枢神经系统灌注损伤，造成运动神经元缺血性退变。临床研究已证实，ALS患者缺氧时VEGF反应性生成异常，脑脊液中VEGF水平降低［2］。实验也证实，长期缺血造成活性氧分子堆积，氧自由基受损，长年反复的神经血流灌注不足造成神经元受损，最终导致神经元变性［3］。因此，长期缺血可解释大部分神经退行性疾病患者在老年发病的现象。其中长期缺血可能与血管调控受损相关，也会造成低水平VEGF，继而导致神经元变性和VEGF介导的内皮细胞发生一氧化氮氧化反应［4］。本研究主要目的是初步探讨外源性VEGF对脊髓运动神经元及其磷脂 酰 肌 醇 3-激 酶 （Phosphatidyl-inositol 3-kinase，PI3／K）信号通路的作用，探讨在存在外界刺激的前提下VEGF如何保护细胞生存，避免运动神经元损伤。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康新生24 h Sprague-Dawley（SD）清洁级大鼠60只（上海斯莱克实验动物有限责任公司提供）。

1.2 主要试剂 Leibovitz＇s L-15培养基，PI3／K 单克隆抗体（Millipore），重组小鼠 VEGF165（Santa Cruz），神经重丝抗体（200KD SMI-32）（ABCAM），LY294002（Calbiochem），MTT（invitrogen），FITC标记羊抗兔IgG（Jackson）、羊抗兔IgG（H＋L）／HRP（Jackson），Hoechst 33342、TMB显色液（碧云天）。

1.3 细胞模型的制备 无菌条件下获得新生SD大鼠的脊髓细胞，通过梯度离心法纯化胞体较大的运动神经元；经Leibovitz＇s L-15培养基培养，发现培养至12 h大多神经细胞贴壁生长，培养至4～6 d可获得胞体饱满、突触明显的神经元。超过2周后部分细胞死亡。可通过SMI-32免疫荧光染色，鉴定为脊髓运动神经元。

1.4 细胞损伤模型的建立 在上述基础上建立Glu的运动神经元损伤模型；通过设立对照组及Glu梯度浓度组：按照有无Glu干预分成Glu组和对照组；Glu组中按照浓度高低分三组，浓度分别为0.5 umol／ml，5 umol／ml，20 umol／ml。脊髓运动神经元培养4 d后Glu组加入外源性Glu，对照组则加入同体积PBS溶液，然后继续培养48 h，用四甲基偶氮唑盐比色法［3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-zy1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT］测定各组运动神经元的细胞活力，筛选出合适的Glu损伤浓度。

另外，用相同的方法筛选外源性VEGF干预的梯度浓度：0.1 ug／ml，1 ug／ml及10 ug／ml，从中得出对脊髓运动神经元具有保护作用的工作浓度。

1.5 外源性VEGF对Glu损伤的运动神经元及其PI3／K的作用

适宜浓度的Glu和不同浓度的VEGF共同干预，了解VEGF对Glu损伤运动神经元的保护作用。通过PI3／K拮抗剂Ly294002阻断上述过程中PI3／K通路，观察脊髓运动神经元的存活数量及生长活力。

1.5.1 组别 在脊髓运动神经元培养4 d后按下列要求分组干预；同时设立对照组，即加入同体积20%血清培养液，共同继续培养48 h；VEGF组：经筛选，设立 VEGF 0.1 ug／ml组和 VEGF1 ug／ml组；Glu组：经筛选，设立适宜浓度的Glu组；干预组：将 VEGF和Glu共同作用，因此分2组，即VEGF0.1 ug／ml＋工作浓度的Glu组和VEGF1 ug／ml＋工作浓度的Glu组，PI3／K组。即在对损伤脊髓运动神经元有较好保护作用的干预组中加入PI3／K抑制剂LY294002 1 uM／ml。

1.5.2 通过MTT法测定各组脊髓运动神经元的细胞活力，酶联免疫级联检测法（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA）检测脊髓运动神经元表达PI3／K的情况，在酶联免疫检测仪OD值630nm处测量各孔的吸光值（OD）。

2 结 果

体外培养的运动神经元通过神经重丝抗体（SMI-32）对其骨架蛋白进行染色鉴定，明确培养神经元的数量情况（图1）。

图1 体外培养的运动神经元

2.1 不同浓度谷氨酸对脊髓运动神经元的毒性损伤作用 MTT法检测大鼠脊髓运动神经元的细胞活力（表1）。因此，得出体外培养的运动神经元随着兴奋性氨基酸浓度增加，存活的前角细胞数量减少。但由于Glu 20 umol／ml干预下的运动神经元死亡率过高，不宜在此基础上再进行更多的研究。故选择Glu 5 uM／ml作为适合脊髓运动神经元研究的毒性损伤浓度。同样方法，筛选出VEGF 0.1 ug／ml及1 ug／ml为适宜的脊髓前角神经元保护浓度。

表1 Glu对各组细胞活力的作用

2.2 外源性VEGF对损伤脊髓运动神经元的保护作用及其PI3／K的表达影响

2.2.1 MTT法检测各组细胞活力 比较VEGF1 ug／ml＋Glu组与Glu组发现，VEGF组的细胞活力明显增加。再比较VEGF 0.1 ug／ml＋Glu组与VEGF1 ug／ml＋Glu组发现，中剂量VEGF组较低剂量组的细胞活力明显增加（表2）。

另外，比较VEGF1 ug／ml＋Glu组与VEGF1 ug／ml＋Glu＋PI3／K组发现，抑制剂LY294002可减少VEGF对脊髓运动神经元Glu损伤的保护作用。

表2 MTT法测各组细胞活力吸光度

2.2.2 免疫荧光标记检测脊髓运动神经元的PI3／K表达水平 通过免疫荧光染色发现，各组间的脊髓运动神经元的细胞核周围均有PI3／K表达，但PI3／K表达水平不同，即VEGF组的荧光强度＞干预组＞PI3／K组（图2）。

2.2.3 Elisa法检测脊髓运动神经元的PI3／K表达水平 比较VEGF1 ug／ml＋Glu组与Glu组发现，前者运动神经元的PI3／K表达较后者显著增高（P＜0.05）。再比较 VEGF 0.1 ug／ml＋Glu组与VEGF1 ug／ml＋Glu组发现，两组间运动神经元的PI3／K 表 达 存 在 明 显 差 异 （P＜0.05）。 经LY294002的抑制，VEGF干预的作用因受到抑制而减弱，且两组比较具有明显差异（P＜0.05）（表3）。

3 讨 论

ALS以渐进性四肢及延髓肌肉的无力萎缩为主要临床表现，其中散发型约占90%。通过ALS病理比较证实，由于患者神经突触素的减少，相关表现为VEGFR-2染色减少，VEGF和血管内皮生长因子受体-2（vascular endothelial growth factor re-ceptor-2，VEGFR-2）均呈低表达，提示了 VEGF的表达与更多的ALS患者发病相关［4］。而且，通过基因敲除VEGF前体中的缺氧应答元件而建立的VEGFθ／θ转基因小鼠，其成年时出现四肢无力，病理显示该转基因小鼠的脑干和脊髓中运动神经元退行性改变，而且病程上与SOD1 G93A转基因小鼠以及ALS患者的病程相类似［5］。因此，从蛋白表达和基因突变的方面均说明了ALS与VEGF水平相关。Matsuzaki等发现VEGF能通过胎肝样激酶（Fetal liver kinase-1，Flk-1）／类Fms受体酪氨酸激酶-1（fms-like receptor tyrosine kinase-1，Flt-1）受体，PI3／K／丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Ser／Thr protein kinase，Akt）通路，促分裂原活化蛋白激酶激酶（MAP／ERK Kinase，MEK）／细胞外信号调节激酶（Extracellular signal Regulated Kinase，ERK）的保护通路，从而避免脊髓运动神经元的缺氧损伤［6］。Tplosa等发现VEGF亦能通过VEGFR2活化PI3－K／Akt信号通路，并抑制抗凋亡或抗细胞毒性蛋白Bcl-2和存活素的下调［7］。Dewil等发现 VEGF能阻断p-Akt的丢失，抑制突变SOD1依赖性的细胞死亡［8］。理论上来说，VEGF与VEGF受体结合后除了激活PI3-K／Akt通路外，还应激活了PKC通路和MAPK通路，可促进细胞增殖、基因表达以及通透性增加。而对于运动神经元病来说，最为重要的就是PI3／K通路激活，保护细胞存活。

表3 各组PI3／K表达量的比较（ELISA法）

图2 免疫荧光标记各组别脊髓运动神经元PI3／K的表达水平 Hoechst标记为细胞核（蓝色），PI3／K所标记为运动神经元的PI3／K蛋白（绿色）。Glu组为Glu5 umol／L损伤组，细胞数量减少，细胞内PI3／K表达较少，细胞间突触很少；VEGF＋Glu组为VEGF1 ug／ml＋Glu组，细胞数量较多，细胞内PI3／K表达密集，细胞间突触较多；PI3／K组为VEGF1 ug／ml＋Glu＋Ly294002组，细胞数量一般，细胞内PI3／K几乎不表达，细胞间突触很少。标尺为200μm

体外培养原代的脊髓运动神经元具有一定的难度，本研究采用了梯度离心的方法，成功分离出纯度较高的前角运动神经元进行培养。由于脊髓运动神经元的培养受限于新生SD鼠的个体较小，经梯度离心后所获得总细胞数量有限，不适宜做免疫印迹法半定量检测细胞蛋白及其保护通路中的磷酸化水平。所以，本研究通过免疫荧光法证实细胞膜蛋白PI3／K在前角运动神经元上表达，再通过HRP标记ELISA法半定量测定PI3／K表达情况。

由于VEGF干预浓度的增加可增加脊髓运动神经元的细胞存活数量，促进细胞形态的生长。在此基础上本研究通过免疫荧光法标记PI3／K观察发现，抑制剂组的细胞数目及形态较小，且PI3／K表达很低。在中低剂量VEGF干预下由Glu引起的兴奋性氨基酸毒性可影响脊髓运动神经元PI3／K表达，对脊髓运动神经元产生损伤，且降低脊髓运动神经元PI3／K的表达。

进一步通过MTT法检测Glu损伤的脊髓运动神经元的细胞活力发现，随VEGF干预浓度增高，前角运动神经元活力增加、PI3／K表达增加，而PI3／K抑制剂LY294002可部分抑制上述细胞活力的增加，明显降低了VEGF干预后的脊髓运动神经元细胞膜上PI3／K的蛋白表达。另外，还发现体外培养的运动神经元随着Glu浓度增加，存活的运动神经元细胞活力降低。

因此，推测VEGF对抗Glu对脊髓运动神经元的作用可能是部分通过PI3／K信号通路完成，在中低剂量VEGF范围内成“量效关系”。

本研究从细胞形态、细胞活力两个方面，评价VEGF干预下Glu损伤的脊髓运动神经元PI3／K表达的水平，且经PI3／K抑制剂LY294002干预部分阻断了VEGF的作用，证实了VEGF部分通过对PI3／K的调节作用，且可影响运动神经元的数目、细胞活力及PI3／K的表达。另外，PI3／K表达与细胞活力的一致性，也提示PI3／K与运动神经元细胞活力相关，即PI3／K增高时，细胞活力较好。

当然，由于细胞培养后期受各种干预的影响，会影响细胞存活的数量和大小，不可避免在ELISA测定PI3／K蛋白浓度时造成误差。但本体外研究证实了Glu损伤的脊髓运动神经元可通过VEGF干预减轻损害，并提高运动神经元的PI3／K表达水平，若经PI3／K可部分阻断了这种保护作用，这为在今后研究中进一步探索此信号通路上下游的信号蛋白表达情况提供新思路。

1 Lambrechts D，Storkebaum E，Morimoto M，et al.VEGF is a modifier of amyotrophic lateral sclerosis in mice and humans and protects motoneurons against ischemic death.Nat Genet，2003，34（4）：383-394.

2 McCloskey DP，Hintz TM，Scharfman HE，et al.Modulation of vascular endothelial growth factor（VEGF）expression in motor neurons and its electrophysiological effects.Brain Res Bull，2008，76（1-2）：36-44.

3 Newbery HJ，Abbott CM.Of mice，men and motor neurons.Trends Mol Med，2002，8（2）：88-92.

4 Bearden SE，Segal SS.Microvessels promote motor nerve survival and regeneration through local VEGF release following ectopic reattachment.Microcirculation，2004，11（8）：633-644.

5 Oosthuyse B，Moons L，Storkebaum E，et al，Deletion of the hypoxia-response element in the vascular endothelial growth factor promoter causes motor neuron degeneration.Nat Genet，2001，28（2）：131-138.

6 Matsuzaki H，Tamatani M，Yamaguchi A，et al.Vascular endothelial growth factor rescues hippocampal neurons from glutamate-induced toxicity：signal transduction cascades.FASEB J，2001，15：1218-1220.

7 Tolosa L，Mir M，Asensio VJ，et al.，Vascular endothelial growth factor protects spinal cord motor neurons against glutamate-induced excitotoxicity via phosphatidylinositol 3-kinase.J Neurochem，2008，105（4）：1080-1090.

8 Dewil M，Lambrechts D，Sciot R，et al.Vascular endothelial growth factor counteracts the loss of phospho-Akt preceding motor neurone degeneration in amyotrophic lateral sclerosis.Neuropathol Appl Neurobiol，2007，33（5）：499-509.