余 樱 张兆辉 喻志源 王 伟

视网膜母细胞瘤蛋白（Retinoblastoma protein，Rb）及其相关蛋白（p107，p130）被认为是细胞周期G1／S期转变的“检验点”。在应对中枢神经系统损伤时，终末分化的成熟神经元保留细胞周期再活化的能力，尝试通过“检验点”再次进入细胞周期。有研究发现神经元暴露在不同的死亡刺激中均能检测到磷酸化的Rb［1］，提示Rb信号途径可能在缺血后神经元凋亡中起重要作用，但是Rb和神经元凋亡的准确关系、参与神经元凋亡的具体机制仍然不明确。本研究采用离体培养的皮层神经元糖氧剥夺（Oxygen-glucose deprivation，OGD）再给氧实验，探讨OGD诱导体外培养的神经元细胞内磷酸化Rb（phospho-Rb，p-Rb）的表达变化特点及其与神经元凋亡的关系，尝试从神经元细胞周期调控的角度来阐述缺血缺氧诱导神经元凋亡的可能机制。

1 材料与方法

1.1 大鼠皮层神经元的原代培养

按照Katchanov的方法［2］稍加改进。取24 h内新生的SD大鼠大脑皮层，0.125%胰酶-0.02%EDTA37℃消化15 min，1000 r／min室温离心3 min，弃上清，在含10%胎牛血清的DMEM／F12培养液中重悬，吹打分散成细胞悬液，经直径70μm的筛网过滤，以3.5×105／ml的细胞密度接种于多聚赖氨酸（0.1 mg／ml）包被过的24孔板中，于37℃5%CO2培养箱内培养，第2 d更换神经元培养基（Neurobasal-A＋2%B27＋0.5 mM L-谷氨酰胺），以后每3 d半量换液一次，选取第7 d的细胞进行实验研究。

1.2 糖氧剥夺模型制备

参考Gwag的方法［3］制备OGD模型。将培养的皮层神经元随机分为对照组、糖氧剥夺1 h后恢复糖氧供给（OGD／R）6、12、24 h组。OGD／R各组神经元加入不含糖Earl’s平衡盐溶液（EBSS：116.4 mM NaCl，0.8 mM MgSO4，5.4 mM KCl，2.6 mM NaH2PO4，26.2 mM NaHCO3，1.8 mM CaCl2，and 20.1 mM HEPES pH7.4）后放入缺氧培养箱（93%N2，5%CO2，＜2%O2）37℃培养1 h，对照组加入含糖EBSS（EBSS加5.6 mM葡萄糖）放入正常条件培养箱37℃培养1 h。此后，对照组和OGD／R各组神经元均换成神经元培养基正常条件培养，规定时间点取出细胞进行相关检测。

1.3 OGD／R各时间点神经元微管相关蛋白2（Microtubule-associated protein 2，MAP-2）与p-Rb免疫荧光细胞化学双标记染色

各组细胞爬片于相应时间点去除培养基，PBS漂洗，甲醇室温固定15 min，0.2%Triton-PBS液中透膜15 min，加封闭液（10%BSA-PBS）室温封闭2 h，滴加比例稀释的小鼠抗 MAP-2单克隆抗体（Chemicon，1∶100）和兔抗磷酸化Rb（ser 795）多克隆抗体（Cell Signaling，1∶100）4℃孵育过夜，弃一抗，滴加CY3标记羊抗兔IgG（Jackson ImmunoResearch，1∶200）和FITC标记羊抗鼠IgG（Jackson ImmunoResearch，1∶200）室温避光孵育40 min，弃二抗，滴加核染料DAPI（5 mg／ml）复染10 min，流水冲洗后50%甘油封片。

1.4 细胞凋亡（TUNEL）染色与p-Rb双标记荧光染色

TUNEL染色方法按照试剂盒（Clontech）说明书进行操作。各组细胞爬片于相应时间点固定、透膜，滴加Equilibration Buffer室温放置10 min，滴加TdT Incubation Buffer混合液湿盒中37℃避光孵育1 h，2×SSC Buffer室温终止反应，滴加上述比例稀释的兔抗磷酸化Rb（ser 795）多克隆抗体4℃孵育过夜，依次滴加羊抗兔CY3二抗、核染料DAPI孵育，冲洗封片如上述。荧光显微镜下观察、照相。计算随机不重复的6个高倍（×400倍）视野下TUNEL或p-Rb阳性细胞数或两者共定位细胞占DAPI数量的百分比（n＝3），计算阳性率。

1.5 统计学处理

采用SPSS11.0统计软件。实验数据均以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用方差分析，继以LSD进行两组间差异性检验。

2 结 果

2.1 OGD诱导神经元 MAP-2与p-Rb表达的特点

对照组 MAP-2在神经元胞浆表达，显示神经元胞体呈锥体状，形态完整，突起分2～3支，细长连续，与相邻神经元突起之间相互连接成网，仅有少数神经元胞核或者胞浆有p-Rb弱表达。OGD／R6 h组观察到MAP-2显示神经元的突起断裂不连续，p－Rb主要在神经元胞浆表达，表达率较对照组增多，达到神经元总数的20～30%。OGD／R12 h，神经元突起断裂，相互之间失去连接，网络紊乱，此时p－Rb的表达达到高峰，约有40～50%的神经元p-Rb在胞浆强表达。OGD／R24 h，约有将近一半的神经元结构不完整，破碎零散，p-Rb表达稍有减少。

2.2 OGD诱导神经元p-Rb表达与凋亡的关系

对照组中只有5%～10%的神经元p-Rb在胞浆内弱表达，极少能与TUNEL染色共定位。OGD／R6 h，p-Rb表达增强，凋亡细胞数开始增多，两者共定位的细胞比例增高，OGD／R12 h，p-Rb表达达到高峰时，几乎所有凋亡的细胞均与p-Rb共定位（图1）。OGD／R 24 h时虽然p-Rb表达和TUNEL均维持在比较高的水平，但是很少观察到两者共定位表达（图1），提示Rb磷酸化可能参与OGD诱导的神经元早期凋亡过程。

3 讨 论

图1 各组神经元p-Rb标记、TUNEL标记和两者共定位标记的细胞比例

既往认为神经元为终末分化细胞，一旦分化完成，就不能再进行分裂增殖。精确调控细胞周期进程对于维持神经元表型及存活十分关键。大量研究证据显示在应对中枢神经系统损伤时，神经元保留了细胞周期再活化的能力，尝试通过“检验点”再次进入细胞周期［4］。Rb被认为是神经元细胞周期再进入和可能引起凋亡的一个“门卫”［5］。非磷酸化状态的Rb通过与转录因子E2F1结合阻滞其相关基因的转录而使细胞停留在G1期，而Rb翻译后的磷酸化修饰参与神经元的细胞周期诱导［6］。Rb磷酸化导致E2F1／Rb复合物解离和E2F1释放，促进细胞进入S期和凋亡［6］。有报道卒中模型中神经元表达磷酸化Rb增加［7，8］，但它参与神经元凋亡的具体机制不清楚。Rb磷酸化在脑缺血后神经元中表达如何变化，如何参与神经元的细胞周期调控并导致凋亡？本研究发现糖氧剥夺诱导的神经元损伤导致神经元细胞内Rb磷酸化表达增加，这些细胞在损伤早期即发生凋亡，提示Rb可能通过诱导缺血缺氧神经元细胞周期紊乱参与其早期凋亡过程。

MAP-2是神经元的细胞骨架成分，作为神经元的标记物，用来观察OGD／R不同时间点神经元细胞骨架形态的变化。对照组中，MAP-2存在于神经元的胞浆和突起中，相邻细胞突起相互交联，连接成网络。当遭受OGD损伤后，首先观察到MAP-2标记的神经元突起断裂不连续，接着突起之间失去连接，网络紊乱，最后观察到将近一半的神经元结构欠完整，部分破碎零散，表明OGD1 h后恢复糖氧供给处理成功地对培养的皮层神经元造成缺血缺氧损伤，为后续OGD诱导的神经元细胞周期改变及凋亡建立有效细胞模型。

本研究对培养的皮层神经元糖氧剥夺后再恢复糖氧供给，来诱导神经元损伤。我们的结果显示神经元OGD处理后，ser 795位点磷酸化的Rb蛋白在早期（6 h和12 h）即表达迅速增加，提示这些神经元正常细胞周期调控已被打乱，同时，我们观察到损伤早期大部分发生Rb磷酸化的神经元能与TUNEL染色共定位，说明OGD损伤的大部分神经元通过Rb磷酸化导致其原有的细胞周期紊乱，但是这些神经元最终结局不是增殖而是凋亡。

我们在研究中发现，神经元暴露于OGD处理后，p-Rb表达在复氧后6 h和12 h显著增加，OGD／R12 h，p-Rb表达达到高峰时，几乎所有TUNEL染色细胞均与p-Rb共定位，但在OGD／R 24 h，虽然p-Rb表达和TUNEL染色细胞比例均分别维持在比较高的水平，却很少观察到两者共定位表达，提示Rb磷酸化介导的神经元细胞周期紊乱可能是OGD诱导的神经元早期凋亡机制之一。

Rb磷酸化能决定他自身与转录因子E2F1结合以及阻止E2F1转录的能力。Rb的磷酸化调控细胞通过G1期限定点并进入S期，是由细胞周期蛋白（cyclin）D，E，A和对应的细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）连续调节的过程。正常情况下神经元内的细胞周期蛋白是稳定而有序的表达，但是当神经元受到各种损伤刺激后，细胞周期蛋白被激活并无序紊乱表达，再表达的CDKs使Rb磷酸化并从转录抑制复合物E2F1／Rb上脱离，启动E2F1依赖的凋亡蛋白（如p53，caspase家族，Bax等）的表达来诱导神经元凋亡［9，10］。根据细胞的状态，E2F能诱导一些凋亡途径：1）激活b-myb和c-myb基因；2）增加caspase-3，-9，-8和 Apaf-1的表达；3）激活p53和p73，p53和p73激活前凋亡Bcl-2家族成员，释放线粒体前凋亡蛋白如细胞色素c等［9］。

总之，我们发现OGD处理的成熟神经元通过Rb磷酸化导致细胞周期紊乱，并诱导其发生早期凋亡，推测Rb磷酸化介导的神经元细胞周期紊乱可能是缺血缺氧诱导的神经元早期凋亡机制之一。

1 Park DS，Obeidat A，Giovanni A，et al.Cell cycle regulators in neuronal death evoked by excitotoxic stress：Implications for neurodegeneration and its treatment.Neurobiol Aging，2000，21（6）：771-781.

2 Katchanov J，Harms C，Gertz K，et al.Mild cerebral ischemia induces loss of cyclin-dependent kinase inhibitors and activation of cell cycle machinery before delayed neuronal cell death.J Neurosci，2001，21（14）：5045-5053.

3 Gwag BJ，Lobner D，Koh JY，et al.Blockade of glutamate receptors unmasks neuronal apoptosis after oxygen-glucose deprivation in vitro.Neuroscience，1995，68（3）：615-619.

4 Malik B，Currais A，Andres A，et al.Loss of neuronal cell cycle control as a mechanism of neurodegeneration in the presenilin-1 alzheimer＇s disease brain.Cell Cycle，2008，7（5）：637-646.

5 Liu DX，Greene LA.Neuronal apoptosis at the G1／S cell cycle checkpoint.Cell Tissue Res，2001，305（2）：217-228.

6 Dick FA，Dyson N.p-RB contains an E2F1-specific binding domain that allows E2F1-induced apoptosis to be regulated separately from other E2F activities.Mol Cell，2003，12（3）：639-649.

7 Yu Y，Luo X，Ren QG，et al.The involvement of upregulation and translocation of phospho-rb in early neuronal apoptosis following focal cerebral ischemia in rats.Neurochem Res，2009，34（6）：1113-1119.

8 Lazzerini Denchi E，Helin K.E2F1is crucial for E2F-dependent apoptosis.EMBO Rep，2005，6（7）：661-668.

9 Byrnes KR，Faden AI.Role of cell cycle proteins in cns injury.Neurochem Res，2007，32（10）：1799-1807.

10 Nguyen MD，Mushynski WE，Julien JP.Cycling at the interface between neurodevelopment and neurodegeneration.Cell Death Differ，2002，9（12）：1294-1306.