周金敏 周 樱

(武汉新华扬生物股份有限公司，湖北武汉 430074)

水产配合饲料中使用的植物性原料常存在一些非淀粉多糖、果胶等物质，这些物质会影响水产动物对有效营养成分的消化和吸收。复合酶制剂能使这些物质分解为小分子物质，降低消化道的黏度，有效消除这些抗营养因子的不良影响，从而改善水产动物的消化机能。此外，水产动物饲料中蛋白质含量较高，复合酶制剂中的蛋白酶能够补充水产动物内源性蛋白酶的不足，提高蛋白质的利用率。本研究选择草鱼为研究对象，在已有研究的基础上研究直接加酶和降低蛋白后加酶对草鱼生长和消化酶活性的影响，为复合酶在水产饲料中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验鱼

试验草鱼[(40.70±0.52)g]购自仙桃某渔场，为当年同一批苗种。试验前将草鱼集中暂养，用基础饲料驯养3周，使之逐渐适应试验饲料和养殖环境。

1.2 试验设计

试验共分6个组，E1组和E2组为对照组，分别饲喂蛋白水平约为30%和28.5%的基础日粮；E11、E13组在E1组基础上分别添加100 g/t、300 g/t的酶；E21、E23组在E2组基础上分别添加100 g/t、300 g/t的酶。每组设3个重复，每个重复25尾鱼。

1.3 试验饲料

以豆粕、菜粕、棉粕、面粉和麸皮为原料配制饲料。复合酶X由武汉新华扬生物股份有限公司根据水产饲料组成特点设计生产，主要包括蛋白酶、木聚糖酶、纤维素酶等。原料粉碎过60目筛，按配方准确称量各种饲料原料，微量组分采用逐级扩大法混合，先将固体原料及复合酶X混合均匀，后加脂肪和10%左右的水，再次混合均匀，用小型环模颗粒机压制成粒径为2.0 mm的颗粒饲料，晾干后用封口袋包装备用。E1组和E2组的日粮组成及营养水平见表1。

表1 日粮组成及营养水平（%）

1.4 试验过程

试验在水族箱中进行。挑选体格健壮、规格一致的草鱼450尾随机分成6组，每组3个重复。试验开始前，将试验鱼饥饿12 h，每缸称重。试验期间每天分两次（9：00和 16：00）饱食投喂，投喂率约为体重的3%，水温为26℃左右。投喂60 d后饥饿12 h，对各组试验鱼进行称重并计数，每箱取4尾草鱼用于测定蛋白酶和淀粉酶活性。

1.5 样品分析测定方法

1.5.1 测定指标

根据试验始末试验鱼的重量和采食量计算增重率、特定生长率和饵料系数。

增重率（WGR，%）=（Wt-W0）/W0×100；

特定生长率（SGR，%/d）=[（LnWt-LnW0）]/t×100；

饵料系数（FCR）=R/（Wt+G-W0）。

其中：W0、Wt分别为鱼体初始重和终重（g）；t为试验天数（d）；R为投饵量(g)；G为死亡个体重（g）。

1.5.2 消化酶样品制备

试验鱼饥饿12 h后，每个重复随机抽取4尾，于冰盘中迅速解剖，取出肠道，剔除脂肪和结缔组织，等分前、后肠，用冷冻去离子水洗净肠道中的内容物，滤纸吸干水分，剪碎，称重。按1：10（w/v）加入4℃的双蒸水，在组织匀浆器中匀浆（4℃），然后冷冻离心机6 000 r/min离心10 min，取出上清液于4℃冰箱中保存备用，24 h内分析完毕。

1.5.3 蛋白酶活性

参照文献的方法，以2.0%干酪素(0.02 M、pH值8.0左右的磷酸盐缓冲液配制)作底物,取1 ml于30℃水浴预热5 min，加入1.0 ml酶粗提液（对照组先加三氯乙酸使酶失活，再加底物），反应10 min，然后加10%三氯乙酸2 ml，终止反应，过滤，取上清液0.5 ml加0.55 M Na2CO32.5 ml，再加0.5 ml福林酚试剂，于30℃水浴中显色20 min，最后在680 nm波长下比色，以对照组调零，测吸光度。用同样的方法求出标准酪氨酸-吸光度的回归方程，运用回归方程计算经酶分解干酪素所产生的酪氨酸的量（μg）。蛋白酶活性单位：1 g食糜或组织在30℃、pH值8.0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸为一个蛋白酶活性单位（U/g）。

1.5.4 淀粉酶活性

淀粉酶活性采用淀粉酶试剂盒（由南京建成生物工程研究所研制）测定。取底物缓冲液1 ml于30℃预热5 min，在测定管中加入酶液20 μl混匀，准确反应7.5 min，再加入碘应用液1 ml终止反应并显色，随后加蒸馏水6.0 ml（空白管加6.02 ml），混匀，用蒸馏水调零测定660 nm波长下的吸光度。淀粉酶活性单位：1 g食糜或组织在30℃、pH值7.0的条件下，每分钟水解l mg的淀粉为一个淀粉酶活性单位(U/g)。

1.6 数据处理与统计分析

采用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析。当差异显著时，用Duncan's检验法进行多重比较，差异显著水平为0.05。结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 复合酶对草鱼生长性能的影响(见表2)

表2 不同蛋白水平下复合酶对草鱼生长性能的影响

由表2可知，与E1组相比，直接加酶的E11、E13组的增重率分别提高了3.97%、9.69%；特定生长率分别提高了2.44%、6.50%；饵料系数分别降低了3.21%、10.16%；其中，300 g/t的添加组（E13）优于 100 g/t添加组(E11)，E13组的饵料系数显著低于E1组(P＜0.05)。降低1.5个百分点蛋白（E2组）后，草鱼的增重率和特定生长率显著降低；在此基础上添加酶制剂（E21、E23组），草鱼的生长性能变化与E1、E11、E13组的趋势相同，且E23组的增重率、特定生长率和饵料系数均显著优于E2组（P＜0.05）；同时，E21组和 E23组与E1组相比无显著性差异。结果表明，在不同蛋白水平（30%左右和28.5%左右）的草鱼幼鱼饲料中直接添加100～300 g/t复合酶均有改善草鱼生长性能的作用，且添加量的增加对草鱼的生长有促进作用。饲料蛋白含量的降低会影响草鱼的生长性能，但添加该复合酶后有明显的改善，与原蛋白水平下的生长性能无显著差异。

2.2 复合酶对草鱼肠道消化酶活性的影响(见表3)

表3 不同蛋白水平下复合酶对草鱼肠道消化酶活性的影响（U/g）

由表3可见，在E1组基础上直接加酶（E11、E13组），草鱼的肠道蛋白酶活性和淀粉酶活性均有所增加；其中，300 g/t的添加组（E13）高于 100 g/t添加组（E11），E11组的蛋白酶活性及E13组的蛋白酶活性和前肠淀粉酶活性与E1组相比差异显著(P＜0.05)。降低蛋白（E2组）后加酶（E21、E23组），草鱼的消化酶活性变化与E1、E11、E13组的趋势相同，且E21组的蛋白酶活性及E23组的蛋白酶活性和淀粉酶活性与E2组相比差异显著（P＜0.05）。结果表明，在不同蛋白水平（30%左右和28.5%左右）的草鱼幼鱼饲料中直接添加100～300 g/t复合酶均能大幅度提高草鱼肠道消化酶的活性，且与酶的添加量正相关。

3 讨论

植物细胞壁是由多种聚化物（纤维素、半纤维素和果胶等）通过氢键或共价键相互交联组成的，难以被单胃动物和无胃动物利用。水产饲料一般主要由饼粕类和谷类籽实等植物性原料及其副产物组成，其中细胞壁的存在降低了养分的消化和吸收率。在水产饲料中添加外源酶制剂（如纤维素分解酶类）能全面促进饲料中营养成分的消化分解，降低日粮中的多种抗营养因子含量，补充内源性酶的不足，提高动物对营养成分的消化吸收，提高饲料效率，进而提高鱼体的生产性能。周小秋(2001)在含豆粕、菜粕、棉仁粕为主的饲料中添加酶制剂，提高了饲料利用率，降低了鲤鱼消化道的黏性，有利于营养物质吸收，对鲤鱼的增重、饵料系数有显著的影响。张璐等（2009）用非淀粉多糖酶饲喂（1.88±0.01）g大黄鱼，极显著提高了大黄鱼的特定生长率(P＜0.01)。Lin等(2007)在罗非鱼的研究中表明，随复合酶制剂（中性蛋白酶4 500 U/g、β-葡聚糖酶800 U/g和木聚糖酶1 600 U/g）添加量的增加，试验罗非鱼的特定生长率和饲料效率显著增加(P＜0.05)。本试验复合酶主要含有蛋白酶、木聚糖酶和纤维素酶等，在草鱼的饲料中适量添加，能有效降解饲料原料中的纤维素、半纤维素、果胶等抗营养物质，使之转化为消化道能吸收的营养物质，并释放提高饲料效率和有助于改善其他主要营养物质消化吸收的物质，起到了间接营养的作用。

肠道内源消化酶活性反映了肠道对营养物质消化能力的大小。复合酶制剂一定范围内能够补充鱼体内源消化酶的不足。研究显示，外源酶的添加能增加食糜中消化分解产物的含量，刺激肠道化学感受器诱导促胰酶素（CCK）的分泌，进而促进消化酶的分泌。在许多鱼类的肠道黏膜检测到了类似CCK的化合物。肠道接受游离脂肪酸（FFA）和游离氨基酸（FAA）刺激时会引起这一类物质释放，并引发内源酶的分泌。张丽（2008）分别在饲料中添加200 mg/kg复合酶制剂和50～100 mg/kg木聚糖酶，均促进了异育银鲫肠道蛋白酶、淀粉酶及木聚糖酶的分泌，有利于其酶活性的提高（P＜0.05）。NSP酶也提高了罗非鱼肝胰腺和肠道淀粉酶活性，酶活性增长分别达到11.4%和49.5%（Li，2009）。乌兰等（2009）研究表明，在饲料中添加耐高温酶制剂能提高奥尼罗非鱼消化酶活性，当耐高温酶制剂添加量为0.10%时，奥尼罗非鱼的前肠蛋白酶活性和淀粉酶活性以及肝胰脏淀粉酶活性最高，与对照组相比差异显著（P＜0.05）。本试验饲料中含有较多的豆粕、菜粕、棉粕和面粉、麸皮，在其中添加复合酶均在一定程度上提高了蛋白酶和淀粉酶的活性，有助于草鱼更好地消化植物饲料中的蛋白质和碳水化合物，从而达到促进生长的作用，与以上结论一致。

4 结论

①在不同蛋白水平（30%左右和28.5%左右）的草鱼幼鱼饲料中直接添加100～300 g/t复合酶X均有改善草鱼生长性能的作用，且添加量的增加对鱼的生长有促进作用。饲料蛋白含量的降低会影响草鱼的生长性能，但添加该复合酶后有明显的改善，与原蛋白水平下的生长性能无显著差异。

②在不同蛋白水平（30%左右和28.5%左右）的草鱼幼鱼饲料中直接添加100～300 g/t复合酶X均能大幅度提高草鱼肠道消化酶的活性，且与酶的添加量正相关。