彭雪华 龙志敏 骆世芳 贺桂琼 (重庆医科大学儿童医院放射科，重庆 40006)

Nicastrin(NCT)是Yu等〔1〕在2000年分离出的一种与γ-分泌酶功能和β淀粉样蛋白(Aβ)产生有关的重要蛋白质。NCT的构象及蛋白表达水平在γ-分泌酶的激活、AD中Aβ的产生和降解中起重要调节作用〔1～4〕。NCT作为一种蛋白质，它在体内的代谢过程，包括被降解的过程及在细胞中的平衡调节与路径仍无知晓。真核细胞有两条蛋白降解途径:溶酶体途径和蛋白酶体途径。本课题组的前期工作〔5〕初步表明NCT的降解与蛋白酶体途径有关，但是否与溶酶体途径有关尚不清楚。本研究拟用溶酶体酶抑制剂处理稳定表达NCT的细胞株，探讨溶酶体途径是否介导了神经细胞内NCT的蛋白降解。

1 材料与方法

1.1 材料 人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，由加拿大不列颠哥伦比亚大学脑研究中心AD病研究室提供;SH-SY5Y稳定表达NCT的细胞株NCT2(本课题组自制)。

兔抗 NCT N端抗体(Covance Inc，USA);脂质体 Lipofectamine 2000，氯喹(Chloroquine)，NH4Cl(Sigma，USA)。兔抗LAMP2 抗体(abc CAM.Inc，USA)，抗兔 Cy3-IgG、抗鼠 FITC-IgG(Jackson ImmunoResearch，USA);抗mychis抗体9E10由加拿大不列颠哥伦比亚大学脑研究中心AD病研究室馈赠。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和溶酶体酶抑制剂处理 SH-SY5Y稳定表达NCT的细胞株NCT2或未经转染的SH-SY5Y细胞生长至90%融合度时，进行传代，根据实验需求，将细胞种在不同的培养皿，常规37℃、5%CO2孵箱培养。

溶酶体酶抑制剂处理细胞:用溶酶体酶抑制剂氯喹(50 μmol/L)、NH4Cl 50 mmol/L 处理 NCT2 细胞株 24 h。同时，用氯喹处理 NCT2细胞时，设立不同剂量组(0，25，50，100 μmol/L，处理 24 h)和不同处理时间组(0、6、12、24 h，浓度为50 μmol/L)。通过Western印迹检测上述抑制剂对外源性NCT表达的影响。实验中还用氯喹50 μmol/L处理未经NCT质粒转染的SH-SY5Y细胞24 h，通过Western印迹检测该抑制剂对内源性NCT表达的影响。……