洪 燕 ，韩燕全 ，陈 杨 ，萧 伟

（1.安徽中医学院，安徽合肥230031； 2.安徽中医学院第一附院，国家中医药管理局中药制剂三级实验室，安徽合肥230031；3.江苏康缘药业股份有限公司，中药制剂过程新技术国家重点实验室，江苏连云港222001）

黄蒲通窍胶囊为安徽中医学院第一附属医院的医院制剂，是本院神经内科经长期临床实践研制的治疗血管性痴呆的口服胶囊制剂，具有益气补肾、豁痰化瘀之功效，在临床使用了近十余年［1］。黄蒲通窍胶囊处方由大黄、制首乌、石菖蒲等六味中药组成，其中制首乌是该方的主药之一。近年研究表明，制首乌中所含二苯乙烯苷为其主要有效成分之一，具有脑保护、抗衰老、降低胆固醇和保肝等作用［2-3］。本研究选取二苯乙烯苷为指标，建立超高效液相色谱法（UPLC）检测方法，为更好地控制该胶囊的质量提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验仪器

Waters Acquity H-Class UPLC超高效液相色谱仪，包括四元高压梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器以及Empower 2数据处理工作站；AG285型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；水浴锅；电热套；旋转蒸发仪；真空干燥箱；KQ3200DB型超声仪。

1.2 药物与试剂

黄蒲通窍胶囊由安徽中医学院第一附属医院中药制剂三级实验室提供，（批号分别是111015、111117 和 111128）；2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-D葡萄糖苷对照品（批号为110844-201109，供含量测定用，购自中国药品生物制品检定所）；甲醇、乙腈均为色谱纯（美国Tedia公司）；水为屈臣氏蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

参照文献［4-5］HPLC法进行改进，得到本色谱条件。色谱柱为Acquity BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为乙腈∶水（17∶83）；检测波长320 nm；柱温 30℃；流速：0.20 mL/min；进样量 2.0 μL。在上述色谱条件下二苯乙烯苷理论塔板数大于3 000，分离度大于1.5。阴性供试品、二苯乙烯苷对照品及供试品UPLC色谱图见图1。

2.2 对照品溶液制备

精密称取二苯乙烯苷对照品适量，配制成对照品母液，精密移取一定体积对照品制成浓度为0.049 7 g/L的对照品溶液，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.3 供试品溶液的制备

精密称定胶囊内容物0.5 g左右，加入甲醇适量，回流提取30 min，放冷，过滤，加甲醇定容至10 mL量瓶中，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.4 标准曲线的制备

自动进样对照品溶液 1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、5 μL，按“2.1项下”色谱条件测定，以色谱峰峰面积（Y）为纵坐标，以进样浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，线性回归方程及相关系数如下：Y=638 116.3X-200 955.6，r=0.999 8。结果表明二苯乙烯苷在0.049 7 mg/mL～0.248 5 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度实验

取浓度为0.049 7 g/L的二苯乙烯苷对照品溶液，自动重复进样6次，每次2 μL，测得二苯乙烯苷峰面积RSD为1.59%（n=6）。结果表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验

取批号为111117供试品溶液，分别在第0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h，按“ 2.1 项下”色谱条件测定，测得样品中二苯乙烯苷峰面积的RSD为1.46%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性实验

取批号为111117供试品溶液，平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件测定峰面积并计算二苯乙烯苷的含量，其RSD为0.67%（n=6）。

2.8 回收率试验

取已知二苯乙烯苷含量（0.901 mg/g）批号为111117供试品溶液6份，分别加入二苯乙烯苷对照品溶液适量，按“2.3”项下样品溶液的制备进行处理，计算得回收率平均值为98.84%，RSD为2.50%（n=6），结果见表 1。

表1 加样回收率测定结果 （n=6）

2.9 样品测定

将3批样品制成样品溶液，按上述色谱条件测定，结果批号111015、111017和111028的黄蒲通窍胶囊含二苯乙烯苷分别为0.930 mg/g、0.901 mg/g和0.913mg/g。

3 讨 论

本实验采用的UPLC法，具有分析时间短、分离效率高、重复性好、准确简便等优点。据相关文献报道，采用HPLC方法测定二苯乙烯苷成分通常需要测定20min以上［5］，而本实验采用UPLC方法用时4min左右即可完成一次进样，大幅提高了分析速度和效率。

实验中分别考察了Acquity BEHC18（100mm×2.1 mm，1.7μm）、Acquity BEHC18（50 mm×2.1 mm，1.7μm）和Acquity HSST3（50 mm×2.1mm，1.8μm）三种不同型号色谱柱，结果发现Acquity BEHC18（50mm×2.1mm，1.7μm）色谱柱对于所测的目标成分分离度、峰型均较好，且出峰时间短，故选用该型号色谱柱。同时考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸等不同流动相的洗脱条件，结果发现流动相为乙腈∶水（17∶83）对于所测目标分离度、峰型均较好，无干扰，故选用该流动相。同时也考察了柱温及流速，最终以柱温30℃、流速0.20 mL/min分离效果较好。本实验所建立的方法快捷、准确，重复性好，灵敏度高，可用于黄蒲通窍胶囊的质量控制。

［1］陈永华，江停战，张波，等.黄蒲通窍胶囊治疗血管性痴呆的临床观察［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2010，8（1）：41.

［2］赵玲，李雅莉，靳洪涛，等.何首乌提取物对高胆固醇血症大鼠学习记忆及血脂的影响［J］.中草药，2004，35（11）：1 277.

［3］王巍，王丹巧.何首乌脑保护作用机理的进展［J］.中国中西医结合杂志，2005，25（10）：955.

［4］国家药典委员会.中国药典一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010.

［5］李志浩，朱雪松，郑芳，等.高效液相色谱法测定夜宁糖浆中四羟基二苯乙烯苷的含量［J］.中国医院药学杂志，2011，31（2）：170.