方 焕 朱传武 陈 明

人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）催化亚单位可用于评估肿瘤患者病情复发与预后，但用其评估肝衰竭患者的治疗疗效和预后尚未见报道。目前已有研究证实肝癌患者外周血单个核细胞（PBMCs）端粒酶活性可以准确反映癌组织端粒酶的表达情况，检测PBMCs端粒酶活性可以作为一种灵敏、微创的早期诊断肝癌的方法[1]。本研究试图通过观察60例肝衰竭患者入院时以及治疗后28天PBMCs hTERT mRNA的动态变化，以探讨hTERT mRNA在肝衰竭预后判断中的价值。

资料与方法

一、病例来源 选择2010年11月至2011年8月我科收治的肝衰竭患者60例，男46例，女14例，年龄20～73岁，平均年龄47.0±13.4岁。其中亚急性肝衰竭2例，慢加急性或亚急性肝衰竭33例，慢性肝衰竭25例。肝衰竭的诊断依据2006年中华医学会感染病学分会肝衰竭与人工肝学组和中华医学会肝病学分会重型肝炎与人工肝学组制定的《肝衰竭诊疗指南》[2]。排除合并有原发性肝癌、消化道肿瘤等恶性肿瘤患者。另选20例健康体检者，男10例，女10例，年龄25～45岁，平均年龄31.4±7.1岁。

二、PBMCs的分离 采集空腹静脉血5ml，用淋巴细胞分离液分离PBMCs，收集细胞并储存于－80℃冰箱待检。

三、hTERT mRNA水平检测 提取细胞总RNA，实时荧光定量PCR分两步进行，第一步即cDNA的合成：以 Oligo（ dT）为引物，取 5μl总 RNA为模板，按照PrimeScript逆转录试剂盒说明书合成cDNA；第二步即实时PCR反应，取4μl cDNA为模板，加hTERT和β-actin引物（表1），在荧光定量PCR仪上进行扩增。在荧光曲线上读出CT值，以 β-actin为内参照， 用 2-△△CT法计算 hTERT mRNA相对表达量。△CT=样品CT均值-内参照CT均值，△△CT=△CT-（随机阴性对照样品CT均值-该样品内参照CT均值）。……