王林枫 赵志伟 杨改青 王月影 朱河水 韩立强 张 震 杨国宇*

(1.河南农业大学农业部动物生化与营养重点实验室，郑州 450002;2.平顶山市畜牧局，平顶山 467000;3.河南农业大学生命研究中心，郑州 450002)

内毒素(lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性细菌(G-)细胞壁分解后释放出的含脂多糖类物质[1]，可导致机体的热源性反应。正常情况下，机体内少量LPS随门静脉血进入肝脏，与肝脏枯否细胞上的Toll样受体4(TLR4)结合，启动肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)、白细胞介素 -1β(IL-1β)等促炎症因子的转录，进一步引起炎症反应。少量的LPS刺激可以提高机体的免疫能力，当过量LPS进入肝脏则会引起强烈的炎症反应，影响肝脏营养代谢并降低动物的免疫能力，严重的还会发生内毒素血症[2]。研究报道，当动物发生内毒素血症时，肝脏[3]、肾脏[4]、肺脏[5]等内脏器官受到严重的损伤。由此可见，肝脏是最易受LPS伤害的主要靶器官之一，但过量的LPS进入肝脏后对肝脏营养代谢的影响还未见报道。本试验以奶山羊为研究对象，通过研究LPS所致急性肝脏损伤对肝脏营养物质代谢的影响，探索LPS对肝脏营养代谢的作用机制，为在生产中消除或减少LPS对动物健康和生产性能的影响提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与分组

选用健康、体况相近、年龄2.5～3.0岁、体重35～40 kg的关中奶山羊母羊18只，随机分为3组，每组6只，分别作为对照组(CTL组)、试验Ⅰ组(TⅠ组)和试验Ⅱ组(TⅡ组)。

1.2 饲养管理及饲粮组成

试验羊饲喂于代谢笼(专利号:2009203148043)内，单笼饲养，饲粮和饮水分别从料槽和水槽供给，定量饲喂，自由饮水。根据NRC(2007)[6]山羊饲养标准设计饲粮配方(表 1)，饲粮精粗料比为30∶70(干物质基础)，干物质中粗蛋白质含量为13.21%。饲喂量按山羊体重的3%供给，预试期14 d。

表1 饲粮组成及营养水平(风干基础)Table1 Composition and nutrient levels of the diet(air-dry basis)

1.3 试验处理

试验前对所有试验羊称重，并依据体重调整LPS注射液的浓度[试验前预先把LPS配制成0.5 mg/mL的溶液，LPS购自Sigma公司，其组成为大肠杆菌(E.coli)055∶B5]。试验开始时，TⅠ组、TⅡ组奶山羊分别按照100和200 μg/kg BW的剂量从颈静脉注射不同浓度的LPS注射液30 mL，CTL组奶山羊注射相同体积的生理盐水，详细方法及剂量参考Dow等[7]。

1.4 血样采集与处理

分别在注射 LPS 后 0、1、4、8、12、24 h 从奶山羊的颈静脉采血，每次采血时用真空抗凝采血管采血5 mL，立即以3 000 r/min离心15 min(离心机型号:TDZS-WS，湘仪离心机厂)，分离血浆，置于EP管中，于-20℃保存待测。

1.5 指标测定及方法

肝脏代谢功能指标包括谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)，营养代谢指标包括葡萄糖(GLU)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HVDL)、总胆固醇(CHOL)、尿素氮(UN)。上述指标均采用全自动生化分析仪(Olympus AU640)检测，ALT、AST测定试剂盒购自上海长征复星生物科技有限公司，其他指标测定试剂盒购自山东奥期帮生物科技有限公司。

1.6 数据统计分析

试验数据用Excel 2007进行初步整理，应用SPSS 18.0软件进行统计学分析。用协方差分析校正初始值，用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行组间比较，以Duncan氏法进行多重比较，结果均以“平均值±标准差”表示。方差分析中，以P＜0.05为差异具有显著性意义。

2 结果与分析

2.1 LPS对奶山羊肝脏代谢功能的影响

从表2可以看出，血浆ALT活性平均值表现为TⅠ组＞CTL组＞TⅡ组，且 TⅠ组显著高于CTL组(P＜0.05)，CTL组显著高于TⅡ组(P＜0.05)。从各时间点血浆ALT活性的变化趋势来看，在各时间点均表现为TⅠ组＞CTL组＞TⅡ组，在6 h前的各时间点3组之间差异不显著(P＞0.05);12 h时，TⅠ组明显升高，TⅡ组和CTL组基本稳定，但各组之间仍差异不显著(P＞0.05);24 h时，TⅠ组显著高于TⅡ组和CTL组(P＜0.05)，TⅡ组和CTL组之间差异不显著(P＞0.05)。

与血浆ALT活性不同，血浆AST活性平均值表现为TⅠ组＞TⅡ组＞CTL组，TⅠ组显著高于TⅡ组和CTL组(P＜0.05)，但TⅡ组和 CTL组之间差异不显著(P＞0.05)。从各时间点血浆ALT活性的变化趋势来看，1 h后TⅠ组就明显升高，并始终显著高于TⅡ组和CTL组(P＜0.05)，而TⅡ组和CTL组在各时间点均差异不显著(P＞0.05)。

表2 各组奶山羊血浆ALT、AST活性Table2 Plasma ALT and AST activities of dairy goats in different groups U/L

2.2 LPS对奶山羊肝脏糖代谢的影响

从表3可以看出，血浆GLU含量平均值表现为CTL组＞TⅡ组＞TⅠ组，但各组之间均差异不显著(P＞0.05)。随着时间的推移，CTL组血浆GLU含量基本稳定;TⅠ组和TⅡ组血浆GLU含量有较大的变化，表现为先升高，随后迅速降低，6 h时2组都降至最低，以后缓慢回升，TⅠ组回升的速度高于TⅡ组，但2组之间差异不显著(P＞0.05)。

2.3 LPS对奶山羊肝脏蛋白质代谢的影响

由表4可以看出，血浆TP含量平均值表现为CTL组＞TⅡ组＞TⅠ组，TⅠ组和TⅡ组显著低于CTL组(P＜0.05)，而TⅠ组和TⅡ组之间差异不显著(P＞0.05)。从各时间点血浆TP含量的变化趋势来看，CTL组基本稳定，各时间点变化不大;TⅠ组在6 h前持续降低，各时间点差异显著(P＜0.05)，6 h后稍有回升，各时间点差异不显著(P＞0.05);TⅡ组表现为先降低，后稳定，6 h时最低，显著低于0和1 h时(P＜0.05)，6 h后基本稳定，各时间点差异不显著(P＞0.05)。

表3 各组奶山羊血浆葡萄糖含量Table3 Plasma glucose content of dairy goats in different groups mmol/L

血浆ALB含量平均值表现为CTL组＞TⅠ组＞TⅡ组，但各组之间均差异不显著(P＞0.05)。随着时间的推移，CTL组血浆ALB含量基本稳定;TⅠ组和TⅡ组血浆ALB含量逐渐降低，TⅡ组降低的幅度大于TⅠ组，但2组之间差异不显著(P＞0.05)。

血浆UN含量平均值表现为TⅡ组＞TⅠ组＞CTL组，CTL组显著低于 TⅠ组和 TⅡ组(P＜0.05)，但TⅠ组和TⅡ组之间差异不显著(P＞0.05)。随着时间的推移，CTL组血浆UN含量基本稳定;TⅠ组和TⅡ组血浆LDL含量逐渐升高，1 h后显著高于CTL组(P＜0.05)，TⅡ组升高的幅度大于TⅠ组，但除在3和12 h时差异显著(P＜0.05)外，其他时间点均差异不显著(P＞0.05)。

表4 各组奶山羊血浆蛋白质类及尿素氮含量Table4 Plasma protein and urea nitrogen contents of dairy goats in different groups

2.4 LPS对奶山羊肝脏脂肪代谢的影响

由表5可以看出，血浆TG含量平均值表现为TⅠ组＞TⅡ组＞CTL组，TⅠ组和TⅡ组显著高于CTL组(P＜0.05)，而TⅠ组和TⅡ组之间差异不显著(P＞0.05)。从各时间点血浆TG含量的变化趋势来看，从1 h开始的各时间点TⅠ组、TⅡ组均显著地高于CTL组(P＜0.05)，在各时间点TⅠ组均高于TⅡ组，且在3和6 h时达到显著水平(P＜0.05)。

血浆LDL含量平均值表现为TⅠ组＞TⅡ组＞CTL组，TⅠ组显著高于TⅡ组和 CTL组(P＜0.05)，而TⅡ组和CTL组之间差异不显著(P＞0.05)。随着时间的推移，TⅡ组血浆LDL含量基本呈下降趋势，在个别时间点间达到显著差异(P＜0.05);TⅠ组和CTL组血浆LDL含量在各时间点变化不显著(P＞0.05)。

血浆HDL含量平均值表现为TⅠ组＞TⅡ组＞CTL组，TⅠ组显著高于TⅡ组和 CTL组(P＜0.05)，TⅡ组显著高于 CTL组(P＜0.05)。随着时间的推移，TⅠ组血浆HDL含量表现为缓慢升高的趋势，除个别时间点外，大多数时间点差异不显著(P＞0.05);TⅡ组和CTL组血浆HDL含量在各时间点变化不显著(P＞0.05)。

血浆CHOL含量平均值表现为TⅠ组＞TⅡ组＞CTL组，TⅠ组显著高于TⅡ组和 CTL组(P＜0.05)，TⅡ组显著高于CTL组(P＜0.05)。随着时间的推移，CTL组血浆CHOL含量在各时间点变化不显著(P＞0.05);TⅠ组血浆CHOL含量表现为先降低后升高的趋势，6 h后开始升高，24 h时显著高于其他各时间点时(P＜0.05);TⅡ组血浆CHOL含量表现为先升高后降低再升高的趋势，6和12 h时较低，显著低于1 h时(P＜0.05)，其他各时间点之间差异不显著(P＞0.05)。

表5 各组奶山羊血浆中脂类的含量Table5 Plasma lipid contents of dairy goats in different groups mmol/L

3 讨论

3.1 LPS对奶山羊肝脏代谢功能的影响

ALT是肝细胞中主要的代谢酶，是可逆地催化丙酮酸和谷氨酸之间氨基酸转移的酶，以磷酸吡哆醛作为辅助因子。ALT主要存在于肝细胞浆，很少外泄，胞内浓度是血浆浓度的1 000～3 000倍，只有肝细胞受到损伤或坏死，才有大量ALT进入血液，引起血浆ALT活性升高，肝细胞坏死增加1%就可使血浆中ALT活性升高1倍。因此，ALT是反映肝功能损伤程度最敏感的指标之一。本试验中，TⅠ组血浆ALT活性显著高于CTL组，表明100 μg/kg BW 剂量的 LPS对肝细胞已造成明显损伤;TⅡ组ALT活性低于CTL组，表明200 μg/kg BW剂量的LPS对肝脏已不具有损伤，证明LPS对肝脏的损伤与剂量有关，高剂量的LPS可减轻对肝脏的伤害，至于多高剂量时开始减轻，目前还未见研究报道。关于高剂量LPS对肝脏损伤降低的原因，目前的解释是LPS对细胞的作用需通过LPS结合蛋白(LBP)介导与CD14(一种细胞因子，参与LPS的受体组成)形成复合物后才能够与TLR4结合，激活下游信号通路，产生炎症因子，损伤肝细胞。已研究表明，LBP的增敏效应与剂量有关，高剂量的LPS对LBP的增敏效应有抑制作用，抑制了LPS与CD14的结合，从而阻止了LPS所引起的炎症反应，减轻了其对肝细胞的伤害[8]。此外，杀菌通透性增加蛋白(BPI)和HDL均可抑制LPS与受体的结合，降低其对肝细胞的损伤[9-10]。

AST是一种具有磷酸吡哆醛依赖性、由细胞核基因编码的线粒体酶，催化天冬氨酸的氨基转移到α-酮戊二酸形成草酰乙酸和谷氨酸及其逆反应。肝脏内的谷草转氨酶有2种同工酶，分别存在于肝细胞的胞浆内(sAST)和线粒体内(mAST)。当肝细胞受损或任何原因引起肝细胞膜通透性增加时，位于肝细胞内的AST逸出细胞进入血液，使血浆AST活性增高[11]。在肝细胞轻度病变时，仅 sAST释放入血;当病变严重时，mAST也会相继释放入血，故AST活性的高低可反映肝细胞的损伤程度和坏死量[12]。另有研究表明，mAST易于被网状免疫系统清除，其清除率比sAST快5倍。若肝细胞急性损伤得以缓解，则血浆中mAST很快下降，甚至恢复到正常水平[13]。因此，mAST不仅作为判断细胞坏死的指标，也是对肝脏疾病动态监测的指标[14]。本试验中，TⅠ组、TⅡ组奶山羊血浆AST活性高于CTL组，表明TⅠ组、TⅡ组奶山羊的肝脏在LPS的作用下受到损伤;而TⅡ组AST活性低于TⅠ组，表明TⅡ组奶山羊的肝脏损伤有所缓和，证明LPS对肝脏的伤害与剂量有关。

3.2 LPS对肝脏糖代谢的影响

肝脏是反刍动物糖异生的重要器官，大量LPS进入机体以后，会造成急性肝功能衰竭内毒素血症，同时刺激机体产生多种内源性介质和细胞因子，肝脏糖异生受到抑制，导致血糖含量降低[15]。但由于应激，在注射LPS后的短时间内血糖含量表现为升高，之后，随着时间的延长，表现为低血糖症状。此外面，注射LPS后，由于LPS的毒性作用导致细胞缺血缺氧，细胞有氧代谢减弱，无氧酵解增强，对葡萄糖的需求增加，糖异生增强，使血糖含量在短时间内升高。随着时间的推移，由于糖异生受到抑制，最终导致血糖含量降低[16]。本试验中，注射LPS后血糖(血浆葡萄糖)含量表现出先升高后降低的趋势，证明了上述结论。LPS抑制肝脏糖异生的分子机制有待进一步研究。

3.3 LPS对肝脏蛋白质代谢的影响

肝脏在蛋白质代谢过程中起重要作用，血浆内蛋白质几乎全部由肝脏合成，TP主要包括ALB和球蛋白(GBL)，其中ALB占到40% ～60%。血浆ALB是机体各组织合成自身蛋白质的原料，是许多脂溶性物质的非特异性运输载体，在维持血浆胶体渗透压方面也起着重要作用，因此，血浆TP、ALB含量是反映肝脏健康状况的重要指标。本试验中，TⅠ组和TⅡ组TP、ALB含量不同程度地降低，表明肝脏受到损伤后合成蛋白质的能力减弱。

本试验中，TⅠ组和TⅡ组的血浆UN含量升高，表明肝脏内蛋白质的分解增加，产生大量的尿素，在LPS中毒的情况下，奶山羊的采食量和消化活动受到很大影响，尿素循环和再利用减少，使血浆UN含量升高。肾脏是尿素的主要排泄器官。肝损伤后，肾脏的功能受到影响，氮的排泄受到影响。研究发现，LPS诱导后小鼠血清尿素的水平较诱导前显著升高[17]。LPS引起肾功能损伤后，导致尿素排泄障碍，是血浆UN含量升高的另外一个重要原因[18]。本试验中，奶山羊血浆UN含量随着剂量的加大而升高，表明LPS对奶山羊肾脏功能的损伤与剂量呈正相关。

3.4 LPS对脂肪代谢的影响

研究表明，LPS促进脂肪酸氧化，使脂肪分解增强、血脂增高，从而引起肝脏脂代谢紊乱[19-20]。LPS及其他的炎症因子，如TNF-α、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)等，通过刺激肝脏中富含TG的VLDL的释放而使血浆TG含量升高[21];LPS通过降低脂蛋白酯酶(LPL)活性抑制其对TG的清除，炎症也能减少血浆富含TG的脂蛋白的清除[22]。由于肝脏损伤，一方面，VLDL的合成和分泌减少，使血液中游离脂肪酸(FFA)的含量增多，导致大量的TG在肝脏内沉积;另一方面，肝脏内发生大量的氧化，肝脏损伤后其抗氧化能力减弱，大量的自由基在肝脏中蓄积，进一步加重了肝脏的损伤[22]。本试验中，TⅠ组、TⅡ组血浆TG含量均高于CTL组，并随时间延长逐渐升高，与上述研究结果相同;且血浆TG含量TⅡ组较TⅠ组有所下降，表明LPS对TG的升高作用与剂量有关，高剂量的LPS对TG的升高作用反而降低。

HDL和CHOL是肝脏脂肪代谢过程中的重要组成物质。膜转运蛋白三磷酸腺苷结合盒转运体(ABCA1)可将游离胆固醇从胞内流向胞外，与载脂蛋白AⅠ(ApoAⅠ)等结合形成HDL，逆向运回肝脏，在清除外周血胆固醇的过程中发挥作用。研究表明，LPS能干扰CHOL的逆转运过程，通过抑制CHOL逆转运相关蛋白干扰CHOL的逆转运，造成细胞内 CHOL 积聚[22]。Ruan 等[23]研究证实，LPS可抑制ABCA1基因的表达，使细胞内CHOL含量升高;Castrillo等[24]证实，通过肝脏 X受体(LXR)和Toll样受体(TLR)通路交互作用，LPS激活TLR4通路后抑制LXR通路，使巨噬细胞膜转运蛋白ABCA1和载脂蛋白E(ApoE)的基因表达减少，减弱CHOL的逆转运。研究表明，高脂负荷显著下调卵磷脂胆固醇脂酰转移酶(LCAT)mRNA的表达水平，导致血浆LCAT的活性降低，进而使HDL表面游离CHOL的酯化减少，降低了HDL对外周组织CHOL的清除能力，增加动脉粥样硬化(AS)发生的可能性[25]。本试验中，TⅠ组、TⅡ组CHOL含量升高可能是LPS干扰CHOL的逆向转运，导致血液中CHOL无法正常运往肝脏而积聚，并导致HDL含量的上升。

HDL是将肝外组织的CHOL运送到肝脏的运载工具，可以防止游离CHOL在肝外组织细胞上的沉积。HDL主要在肝脏、小肠中合成，降解主要在肝脏中。HDL通过CHOL的逆向转运，把外周组织中衰老细胞膜上以及血浆中的CHOL运回肝脏代谢，是脂代谢中的重要物质。据报道，各种脂蛋白，如 LDL、VLDL、HDL 和 VHDL，对 LPS 均有一定解毒作用，其中以HDL与LPS的结合能力最高，可有效地清除血液中的 LPS[8，26]。但不同剂量的LPS对其与HDL的亲和力以及清除效率的影响，尚待进一步研究。

4 结论

①LPS可引起肝脏损伤，进而对奶山羊肝脏营养代谢造成影响。

②LPS对奶山羊肝脏营养代谢的影响与LPS的剂量有关。

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