李玉红，徐 蕾，李铁臣

(皖南医学院 1.分子生物学研究室;2.生化与分子生物学教研室，安徽 芜湖 241002)

妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是一种妊娠期特有的可逆的肝脏疾病，临床以孕妇皮肤瘙痒、血清胆酸和转氨酶升高为特征［1］。一般在妊娠晚期发病，产后恢复正常，40% ～60%的患者再次妊娠时复发［2］。ICP主要危害胎儿，可导致胎儿宫内窘迫、早产或死胎等［1］。ICP病因不明，已有研究表明，ABCB4(ATP-binding cassette，subfamily B，member 4，ABCB4)基因的突变可能与ICP发生相关，其外显子6是突变热点之一［3-4］。本实验采用聚合酶链式反应(PCR)技术结合DNA序列测定，检测12例ICP患者，以期进一步了解中国人群中ABCB4基因的外显子6的突变情况与ICP发病的相关性。

1 材料与方法

1.1 临床资料 ICP病例诊断参考《妇产科学》［5］:皮肤瘙痒;血清胆酸、血清谷丙转氨酶或谷草转氨酶活性显著升高;流行性病毒标志物均为阴性;无其他能引起瘙痒、黄疸和肝功能异常的疾病。12例ICP患者EDTA抗凝血均来自2009年9月～2012年1月皖南医学院附属弋矶山医院妇产科的住院患者，彼此无亲缘关系。年龄23～30岁，平均为(26.08±2.35)岁。分娩(或剖宫产)前抽取孕妇外周血2 ml，-20℃冻存。

1.2 研究方法

1.2.1 提取基因组DNA 采用本实验室常规酚-氯仿方法抽提12例ICP患者的外周血DNA标本，4℃保存、备用。

1.2.2 聚合酶链式反应(PCR) 外显子6的引物序列由Primer 5.0软件设计并在NCBI网站上进行BLAST验证(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)，无误后，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列、产物大小及复性条件见表1。

PCR 扩增体积 50 μl:ddH2O 40μl，10×buffer(含 Mg2+)5 μl，dNTPs(0.2 mmol/L)1 μl，上游及下游引物各 0.5 μl，模板DNA 2 μl，Taq酶(Tiangen公司产品，版本号:PR110413)1μl。PCR反应在热循环PCR仪(美国MJ公司产品)上进行，反应条件为:98℃预变性5 min后，94℃变性30 s(在94℃变性20 s时加入Taq酶，进入热循环扩增)、63℃退火45 s、74℃延伸 l min，35 个循环后，74 ℃延伸4 min。……