唐卫文1，郑骏年2，高 超3*

徐州医学院1研究生院，3附属医院肿瘤科，江苏徐州221006；2江苏省沭阳协和医院肿瘤科，宿迁223600

据最新统计显示，世界癌症死亡病例，食管癌在男性中占第5位，在女性中占第8位。世界癌症新发病例，食管癌在男性中占第6位，在女性中占第10位以上[1]。我国是食管癌的高发区，2007年登记报告数据显示，食管癌发病率为19.86/10万，占第5位；食管癌死亡率为15.80/10万，占第4位。我国食管癌高发区为河南林县、太行山区、苏北地区等[2-3]，食管癌已经成为严重威胁人民健康的重大公共卫生问题之一。食管癌的发生和发展是一个涉及多因素、多阶段、多基因变异积累及相互作用的复杂过程，其具体机制尚不十分清楚。尽管食管癌的治疗技术与手段如手术、化疗及放疗，取得长足的进步，食管癌患者5年生存率仍然较低，仅20～30%[4]。内质网分子蛋白与肿瘤的关系是近年来的研究热点之一，内质网蛋白29（ERP29）的表达与多种肿瘤的关系研究方兴未艾，而其与食管癌的关系国内外文献尚未见相关报道。本研究拟通过免疫组化检测ERP29在食管癌组织及癌旁食管正常组织中的表达，分析ERP29的表达与食管癌临床病理特征以及预后等之间的关系，以明确ERP29在食管癌中的作用，以期指导临床治疗决策。

1 材料和方法

1.1 组织标本及临床资料收集

收集自2007年1月至12月于解放军第82医院（作者单位合作医院）肿瘤中心行手术治疗的60例患者食管癌及癌旁正常组织标本，其中男44例、女16例，年龄42～68岁、平均56岁。并收集患者临床资料包括肿瘤部位、癌组织学类型、分化程度、局部浸润深度、区域淋巴结转移情况、TNM分期及3年以上随访等。食管癌的病变部位分段标准及食管癌的TNM分期标准按国际分期第6版判定。组织学类型主要包括鳞状细胞癌及腺癌。癌细胞分化程度分为高分化癌（G1）、中分化癌（G2）及低分化癌（G3、G4）。

1.2 主要化学试剂及主要仪器

主要化学试剂包括ERP29单克隆抗体购自Abcam 公司；HRP-Polymer抗羊 IgG（PV-6003）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 M，pH 7.2～7.4）、柠檬酸盐缓冲液（0.01 M，pH 6.0）、TBS 缓冲液（100 mL，pH=7.6）、新鲜配制DAB溶液均自配。

主要仪器有AE200电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；OlympusAH-2型显微镜（日本Olympus公司）；微波炉（广东格兰仕电器有限公司）；石蜡切片机（上海倍曼生物科技有限公司）；KWY-450型电热干燥箱（武汉实验仪器厂）；AZ-97自动三重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器有限公司）等。

1.3 免疫组织化学检测ERP29及染色判定

免疫组织化学染色采用SP法。将石腊包埋的食管癌或癌旁组织块切成3 μm厚，于60～65℃烤片4小时，备用。切片脱蜡，水化，依次为二甲笨Ⅰ→二甲苯Ⅱ→无水乙醇Ⅰ→无水乙醇Ⅱ→95%乙醇→90%乙醇→85%乙醇→75%乙醇各10分钟。1×PBS缓冲液洗涤切片3次各5分钟。石蜡切片组织抗原修复，采用高压修复方法:先将切片专用耐高温高压切片架放好，然后放入还没有加热的柠檬酸盐液中；将高压锅盖好放至普通电炉上加热，从开始加热至压力锅喷气约要15 min；从喷气时开始计时，2 min后将压力锅端离电炉；自然冷却压力锅，此过程约15 min；打开锅盖取出切片，1×PBS缓冲液洗涤切片5 min。3%H2O2（以PBS缓冲液）滴加在组织切片上，室温（18～30℃）静置 10分钟。PBS洗 2～3次各1 min。滴加正常山羊血清封闭液，室温10～15 min，甩去多余液体。滴加一抗ERp29抗体（稀释倍数为1∶100），置于湿盒内，4℃过夜，防止切片干燥。阴性对照以PBS代替一抗。1×PBS洗3次各5 min。滴加二抗（HRP-Polymer anti-Goat IgG），室温静置20 min。1×PBS洗 3次各 1 min。DAB显色，在显微镜下掌握染色程度约3～5 min。自来水终止显色。苏木精复染，1%盐酸酒精分化（分化时间为1 s）。自来水冲洗10～15 min。切片脱水、透明、封片，镜检。

免疫组织化学染色的判定以细胞浆中出现棕色颗粒为表达阳性，并用以下标准评价表达程度:着色强度评分:0分，未见染色（-）；1分，染成浅黄即轻度染色（+）；2 分，染成棕黄即中度染色（++）；3分，染成棕褐色即重度染色（+++）。阳性细胞百分比评分:0 分，＜5%；1 分，5%～25%；2 分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，＞75%。依据着色强度评分与阳性细胞百分比两者评分乘积判定表达结果，0～2分判定为阴性，2分以上为阳性（2～4分为弱阳性，5～8分为中等阳性，9～12分为强阳性），阳性占总例数的百分比值为阳性表达率。

1.4 统计学处理

采用统计软件SPSS13.0进行数据处理与分析。ERP29的表达与食管癌临床、病理参数关系的分析采用Wilcoxon Mann Whitney检验。应用Kaplan-Meier法计算累积生存率，并用log-rank进行检验。

2 结 果

2.1 ERP29在食管癌组织和癌旁组织中的表达及关系

ERP29的表达，主要位于细胞质内，表现为细胞质内出现程度不等的棕色颗粒，部分细胞核也有表达。ERP29在食管癌旁组织中的阳性表达率为85%（见图1A），而在食管癌组织中的阳性表达率为43.3%（见图1B），两者相比具有统计学差异（χ2=22.652，P＜0.001）。食管癌旁组织 ERP29的表达上升，而在癌组织的表达明显下降，提示ERP29是一个潜在的抑癌基因。

图1 ERP29的阳性表达（A）食管癌旁组织（B）食管癌组织

2.2 食管癌组织ERP29蛋白的表达与食管癌临床病理特征的关系

卡方检验显示，食管癌组织ERP29的阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤部位、癌组织学类型及局部浸润深度等无明显相关性。但与肿瘤TNM分期及淋巴结转移呈负相关（见表1）。

表1 食管癌组织ERP29蛋白的表达与食管癌临床病理参数的关系

2.3 食管癌组织ERP29蛋白的表达与食管癌预后的关系

食管癌组织ERP29表达阳性组食管癌患者术后1年生存率为92.3%，2年生存率为80.8%，3年生存率为65.4%，平均生存期为35.5个月。食管癌组织ERP29表达阴性组食管癌患者术后1年生存率为79.4%，2年生存率为55.9%，3年生存率为35.3%，平均生存期为28.7个月。根据Kaplan-Meier生存分析和检验，食管癌组织ERP29表达阳性与阴性患者的预后有统计学差异（P=0.037），见图2。

图3 不同ERp29表达的食管癌患者生存情

3 讨 论

ERP29是一种分子量为29kDa的蛋白质，首先克隆于大鼠肝及牙釉质细胞[5-6]，广泛表达于各种组织。ERP29在肿瘤发生、发展中的作用尚不清楚。一些研究发现，ERP29高表达于原发肿瘤及癌细胞株，并与肿瘤生长相关，然而另外一些研究也发现ERP29表达与肿瘤细胞增殖、肿瘤形成呈负相关。ERP29在C末端含有靶向内质网内腔的4肽内质网回收信号序列（KEEL）[5]。在人类，该蛋白质由第12号染色体上的单个基因表达，在哺乳类动物进化中具有高度的保守性[7]。ERP29蛋白具有2个结构域:N-端结构域与C-端结构域，其中N-端结构域与蛋白二硫键异构酶（protein disulfide isomerase，PDI）的硫氧还原蛋白（thioredoxin）结构域类似，但是缺乏Cys-X-X-Cys结构，不能与硫氧还原蛋白结合，因此没有PDI类似的氧化还原作用。C-端结构域为全螺旋结构，与PDI的p5亚族相似。两结构域之间是自由转动的寡氨基酸链。ERP29不同于传统的分子伴侣，不能与ATP结合，亦不能与Ca2+结合[8-9]。ERP29是一个新的辅助蛋白折叠/分泌的内质网蛋白，可协助甲状腺球蛋白及其它蛋白转运至细胞外[10-12]。近年研究表明，ERP29表达与细胞放射、化疗敏感性相关。Zhang等报道，放射处理小鼠肠上皮细胞或IEC-6细胞后，ERP29蛋白及mRNA表达水平均增高，并呈时间依赖性。反义转基因抑制ERP29，IEC-6细胞对放射敏感性增加，细胞损伤加重[13]。Qi等亦报道，放射抗拒鼻咽癌组织与放射敏感鼻咽癌组织相比，前者Erp29表达增高。采用基因敲除Erp29，鼻咽癌细胞株CNE-1放射敏感性降低，但转染ERP29致其过表达，鼻咽癌细胞株CNE-2放射抗拒增加[14]。ERP29的表达亦与肿瘤细胞化疗敏感性相关。Zhang等报道，ERP29的表达可增加乳腺癌细胞株MDA-MB-231对阿霉素的抵抗性，并降低其诱导的细胞凋亡，但ERP29基因敲除后，细胞对阿霉素的毒性增加[15]。进一步研究表明，ERP29降低肿瘤细胞对阿霉素敏感性的机制与Hsp27及PERK相关[15-16]。本课题检测了ERP29在食管癌中表达情况，发现少部分患者存在该蛋白的中等至强表达，提示这部分患者可能对放疗及化疗抗拒，因此对临床治疗决策具有一定指导意义。

ERP29在肿瘤发生、发展中的作用尚不清楚。一些研究发现，ERP29高表达于原发肿瘤及癌细胞株，并与肿瘤生长相关。Myung等采用二维电脉与基质辅助激光解吸附/电离质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF）分析10株不同的癌细胞与正常细胞分子伴侣的表达，发现SK-N-SH（人视神经母细胞瘤）、A549（人肺癌）、A-375（人黑色素瘤）、MCF-7（人乳腺癌）与Hela（人宫颈癌）等细胞株表达ERP29[17]。Cheretis等检测104例皮肤基底细胞癌患者标本，37.5%表达ERP29，其中浸润型癌表达更强，而表浅型表达较弱[18]。Mkrtchian等报道ERP29显性负性突变（dominant-negative）或siRNA介导基因沉默化的人乳癌细胞MCF-7种植瘤，与过表达ERP29种植瘤相比，肿瘤小且分化较好。然而在体外培养ERP29的表达变化不影响细胞增殖。检测人乳腺癌组织及静止期和分泌期小鼠乳腺组织ERP29的表达，25%癌组织及分泌期小鼠乳腺组织表达，但静止期小鼠乳腺组织不表达[19]。

然而另外一些研究也发现，ERP29表达与肿瘤细胞增殖、肿瘤形成呈负相关。Shnyder等报道人乳腺高转移癌细胞MDA-MB-43，与低转移癌细胞MCF-7相比，ERP29表达下降，并且ERP29表达与肿瘤进展呈负相关。由乳腺癌细胞MCF-7或结肠癌细胞COLO 205形成的生长较慢肿瘤，与由乳腺癌细胞MDAMB-435或结肠癌细胞W-620形成的生长较快肿瘤相比，前者ERP29表达增高[20]。Bambang等报道，与非癌组织相比，乳腺癌组织的ERP29表达下降，并与乳腺癌侵袭性特征相关。乳腺癌细胞MDA-MB-231过表达Erp29后，致细胞周期停滞于G0/G1期，并抑制细胞增殖，细胞发生表型改变，即间质-上皮转化（mesenchymal-epithelial transition,MET），表现为细胞骨架重组，压力纤维（stress fibers）缺失，纤维蛋白（fibronectin，FN）下降，上皮细胞标志物E-cadherin活化，间质细胞标志物vimentin丧失，细胞侵袭/转移能力下降。采用shRNA敲除乳腺癌细胞MCF-7的ERP29后，E-cadherin表达下降，vimentin表达上升，并且细胞侵袭性能力增强。过表达ERP29的癌细胞MDA-MB-231种植祼鼠后，肿瘤形成受抑制[21]。因此，ERP29是一个潜在的抑癌基因[22]。本课题检测ERP29在食管癌及癌旁组织中的表达，亦发现食管癌组织ERP29的表达下降，并且ERP29的表达与肿瘤分期、淋巴结转移呈负相关，但与患者年龄、性别、肿瘤部位、癌组织学类型及局部浸润深度等无明显相关性。然而，ERP29抑制肿瘤发展的机制尚不清楚，可能与抑制ERK信号通路等相关[21]。

本组患者食管癌组织ERP29表达阳性组1、2及3年生存率分别为92.3%、80.8%、65.4%，高于食管癌组织ERP29表达阴性组79.4%、55.9%、35.3%。根据Kaplan-Meier生存分析和log-rank检验，食管癌组织ERP29表达阳性与阴性患者相比，有统计学差异。食管癌旁组织ERP29呈高表达，而在食管癌组织ERP29的表达明显下降。并且，食管癌组织ERP29的表达与患者年龄、性别、肿瘤部位、癌组织学类型及局部浸润深度等无明显相关性，但与肿瘤分期、淋巴结转移呈负相关。两者均提示ERP29是一个潜在的抑癌基因。而食管癌组织ERP29的表达与患者预后相关，提示ERP29可作为预测食管癌预后的一个潜在指标。

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