文 勇 Yongil KWON 于 顺

(1.南首尔大学公共卫生管理部，天安331-707;2.翰林大学江东圣心医院妇产科，首尔150-030;3.首都医科大学宣武医院神经生物学研究室，北京100053)

长期饮酒可以造成多种器官损害，包括肝脏［1］、胰腺［2］和大脑［3-4］。体外研究［5-7］也证明，乙醇可以引起多种细胞凋亡。然而，乙醇引起细胞凋亡的早期信号传导机制却不甚清楚。丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)在指导细胞对各种刺激产生反应中发挥重要作用，参与调节多种细胞活动，如增生、分化和凋亡［8］。MAPK信号通路包括3个重要通路［8-9］:①细胞外信号调节激酶，即ERK通路;② c-jun N-末端激酶，JNK通路;③ p38 MAPK(p38K)通路。ERK1和ERK2是增生信号的主要传感器，主要被丝裂原活化。而JNK和p38K则主要被引起细胞应激的各种刺激激活。研究［8-9］表明，JNK和p38K可以介导损害性刺激引起的细胞凋亡。然而，它们在乙醇诱导的细胞凋亡中的潜在作用还未见报道。

本研究将利用培养SK-N-SH成神经瘤细胞研究JNK和p38K通路在乙醇诱导的细胞凋亡中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料

SK-N-SH细胞(American type culture collection，USA);DMEM培养基(fisher bioblock scientific，France);MTS溶液(Promega，USA);抗JNK和磷酸化JNK以及抗p38K和磷酸化p38K抗体(Santa Cruz，USA);辣根过氧化物酶标记山羊抗兔和山羊抗鼠IgG(Vector Laboratories，USA);ECL 显色 液(Promega，USA);caspase-3荧光底物Ac-DEVD-AMC(BD Pharmingen，USA);胎牛血清(Gibco，USA)。

1.2 细胞培养

SK-N-SH细胞在含10%胎牛血清、1%青霉素和1%链霉素的DMEM培养基中于37℃培养箱中培养。培养箱充以5%CO2和95%空气。

1.3 细胞死亡率测定

向乙醇处理后细胞培养基中加入20 μL MTS(5 g/L)溶液，孵育4 h，于490 nm波长处检测各孔的光吸收值。细胞死亡率=对照细胞吸收值-乙醇处理细胞吸收值/对照细胞吸收值×100%。

1.4 DAPI染色

细胞用4%多聚甲醛室温固定30 min，用PBS洗去固定液，然后加DAPI溶液(0.5 ng/L)染色3～5 min。……