孙齐刘世琦张涛陈娴孟凡鲁

（山东农业大学园艺科学与工程学院，作物生物学国家重点试验室，农业部园艺作物生物学重点开放实验室，山东泰安 271018）

大蒜（AlliuMsativuML.）为百合科葱属蔬菜，在我国广泛栽培，由于其花器官退化，多采用蒜瓣进行无性繁殖，较低的繁殖系数严重制约了大蒜生产的发展。为提高其繁殖系数，近年来对如何改进大蒜微繁扩繁技术进行了大量的研究（高山林和金雍安，2000；梁宏霞 等，2010）。大蒜离体繁殖主要有两条途径:一是通过大蒜离体再生途径诱导愈伤组织，进而诱导产生不定芽及不定根；二是用大蒜外植体直接诱导生成不定芽。目前已建立了以茎尖（Novak，1983；赵俊丽 等，2003；于德才 等，2005；宋满坡，2005）、根尖（张昌伟 等，2004）、全展叶（杨乃博，1981）、贮藏叶（周云罗 等，1980）、嫩叶（吕启愚 等，1982）、茎盘切块（薛寒青，2008）、花原始体（王洪隆 等，1992）和气生鳞茎（袁学军和李艳丽，2011）等为外植体的多种大蒜组织培养再生体系；探索了大蒜离体繁殖过程中的影响因素（薛万新 等，1996；李志勇 等，1999）。

大蒜自5月底收获，经历后熟、休眠后，到9月由于夜间温度下降，大蒜鳞茎开始解除休眠（董宇 等，2009）。大蒜在贮藏过程中，鳞茎薄壁细胞衰退，其营养物质供给幼芽萌发生长（张迎迎 等，2004；魏凤菊 等，2005），伴随着幼芽的不断生长，鳞茎逐渐进入衰亡期，营养物质含量下降，酶活性降低（娄成后，1981）。因此，寻找大蒜整个贮藏时期的最佳微繁扩繁时间有着重要的意义，但目前关于这方面的报道还不多见，仅报道了以大蒜休眠芽为外植体的愈伤组织诱导及植株再生（陈光宙 等，2011）。本试验通过对金乡大蒜整个贮存期的不同时期的鳞芽进行同处理的愈伤组织诱导及植株再生的研究，确定大蒜最佳微繁扩繁时间。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2010年5月～2011年7月在山东农业大学园艺科学与工程学院农业部园艺作物生物学重点开放实验室进行。供试大蒜品种为金乡大蒜。

1.2 试验方法

1.2.1 贮存条件 大蒜5月25日收获后自然条件下贮存60 d（6、7月平均温度分别为25.3、27.6 ℃），待外皮干燥时置于冷库（-3 ℃）贮藏至翌年6月。

1.2.2 材料准备 将收获的大蒜鳞茎放置于同一贮藏条件下，每30 d取200粒健康完整的鳞芽，分为2组:一组用于愈伤组织植株再生；一组用于外植体诱导不定芽。每组3次重复。鳞芽剥去外保护皮，在流水下冲洗30～60 min，放入超净工作台，经75%医用酒精处理10～20 s后用0.1%升汞处理20 min，然后用无菌水冲洗6次，待用。

1.2.3 鳞芽愈伤诱导 将灭过菌的大蒜鳞芽切成0.3 cm×0.2 cm×0.2 cm的外植体，接入MS+2.0 mg·L-12，4-D的培养基内，每瓶接种4个外植体，于光照强度为36 μmol·m-2·s-1（每天16 h）、温度为25 ℃条件下培养，15～18 d继代1次，记录出愈时间，30 d后统计出愈率、出愈量、出愈情况。

1.2.4 植株诱导 将愈伤组织切割成0.5 cm×0.5 cm大小，转接入MS+3.0 mg·L-16-BA的分化培养基内，于光照强度为36 μmol·m-2·s-1（每天16 h）、温度为25 ℃条件下诱导不定芽，待不定芽长到一定长度可看到假茎时将其取出，切除多余愈伤组织，接入生根培养基中，7 d后统计不定芽直径、发芽率及平均发芽数。

1.2.5 茎盘不定芽诱导 将切除蒜踵的大蒜鳞芽茎盘切下，每个茎盘分为 4块，厚度大约为 3 mm，接种于MS+2.0 mg·L-12，4-D+1.0 mg·L-16-BA的培养基中进行不定芽诱导培养。每处理接种13瓶，每瓶接种4个外植体，每15～18 d换1次培养基，42 d后观察不定芽的生长情况，统计不定芽诱导结果。然后将不定芽进行切割，接入生根培养基中，统计最早生根时间，7 d后统计生根率及平均生根数。

1.3 数据处理

试验数据采用DPS 6.55和Excel软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 收获后贮藏时间对愈伤组织诱导的影响

如图1所示，随着大蒜鳞茎贮藏时间的延长，大蒜外植体的最早出愈时间呈先减少后增加的趋势，收获后贮藏92 d的大蒜外植体出愈所需时间最少，为12 d；大蒜外植体的出愈率、出愈量及胚性愈伤组织的诱导率均呈先上升后下降的趋势，出愈量在收获后贮藏 61 d时最大，为2.06 g；出愈率和胚性愈伤组织的诱导率在收获后贮藏92 d时达最大，分别为76.9%、100.0%。贮藏时间超过92 d后各指标显著下降。可见大蒜诱导愈伤组织的最佳时期为收获后贮藏61～122 d。

图1 收获后贮藏时间对愈伤组织诱导的影响

2.2 收获后贮藏时间对不定芽诱导的影响

由图2可见，收获后贮藏61～306 d，由接种的外植体诱导出不定芽的直径在1.0～1.2 cm之间；而收获后贮藏336～366 d接种的外植体所诱导出的不定芽直径为0.6 cm，与其他贮藏时间诱导所得不定芽直径差异显著；不定芽发芽率总体呈先上升后下降趋势，收获后贮藏61 d时达到最高点，为98.08%；收获后贮藏30～214 d接种的外植体诱导出的不定芽发芽率变化不明显，为 82.69%～98.08%，而收获后贮藏 245～366 d接种的外植体诱导出的不定芽发芽率呈下降趋势，最低可达61.54%。收获后贮藏92 d时接种的外植体诱导的平均发芽数最多，平均每个外植体可诱导6.4个不定芽，收获后贮藏366 d时最少，平均每个外植体诱导2.4个不定芽。可见诱导不定芽的直径及发芽率受鳞茎贮藏时间影响不大，而平均发芽数受贮藏时间影响较大。

2.3 收获后贮藏时间对不定根诱导的影响

由图3可知，随着大蒜鳞茎收获后贮藏时间的延长，诱导大蒜不定根的最早生根时间先减少后增加，生根所需时间最少的是收获后贮藏92 d时的接种处理，为6 d，而后诱导不定根需要的时间逐渐增长，最长时间为收获后贮藏366 d时的接种处理，为21 d；生根率和平均生根数呈先增加后减少的趋势，最大生根率为收获后贮藏92 d时的接种处理，为98.33%，最少的为贮藏366 d时的接种处理，为15.00%；平均生根数最多的是贮藏61 d时的接种处理，为6.8条，最少的为贮藏366 d时的接种处理，为1.2条。

图2 收获后贮藏时间对不定芽诱导的影响

2.4 收获后贮藏时间对外植体直接诱导不定芽的影响

由图4可知，收获后大蒜鳞茎贮藏92 d时外植体诱导不定芽所需发芽时间最少，为3 d，收获后贮藏306～366 d时外植体诱导不定芽所需发芽时间最长，为7～8 d；不定芽发芽率在收获后贮藏61～183 d较高，在67.31%～75.00%之间，收获后贮藏183～366 d发芽率下降趋势较明显，最低可达19.23%；平均发芽数在收获后贮藏30～122 d时均较高，在5.2～5.7个之间，收获后贮藏245～366 d时平均发芽数显著降低。可见由外植体直接诱导不定芽的发芽时间随贮藏时间的延长呈先下降后上升趋势，且变化幅度较小；而发芽率、平均发芽数总体呈先上升后下降趋势，变化幅度较大。

图3 收获后贮藏时间对不定根诱导的影响

图4 收获后贮藏时间对外植体直接诱导不定芽的影响

3 结论与讨论

本试验结果表明，大蒜鳞茎收获后贮藏 61～122 d时，诱导愈伤组织的出愈率、出愈量及胚性愈伤组织诱导率较高且出愈所需时间较短。这是由于在此期间大蒜鳞芽鞘的薄壁细胞由外至内一层层衰退，将营养物质转运到大蒜鳞芽中；与此同时，在大蒜自休眠至萌发的不同发育进程中，鳞茎中的酶活性增强，且在萌芽期酶活性变化最为强烈（魏凤菊 等，2005）。随着贮藏时间的延长，大蒜鳞茎结束休眠开始萌动，伴随着幼芽的生长，鳞茎中营养物质不断消耗，酶活性下降（娄成后，1981），上述指标开始降低。据刘淑娴等（1996）研究发现，在不做任何处理和包装的情况下，大蒜鳞茎在室温贮藏 2个月中，随着时间的推移呼吸作用增强，可溶性蛋白和 VC含量逐渐增强，而可溶性糖含量逐渐下降，据此推测可溶性糖的一部分作为呼吸基质被消耗，另一部分可能被转化为胚芽中的蛋白质和VC。大蒜鳞茎中较低的酶活性以及较少的营养物质不利于愈伤组织的发生，在本试验中翌年3月（收获后贮藏275 d）的大蒜鳞茎愈伤组织诱导率为 32.69%，少于汤青林等（2006）于 2004年 3月用大蒜鳞茎茎尖诱导大蒜愈伤组织的 60%的诱导率。造成这一差异的具体原因尚不清楚，可能是由大蒜的品种差异、收获后贮藏条件差异及外植体选择差异（李志勇，2000）引起的。

继代培养时发芽率、平均发芽数、不定芽直径，生根率、平均生根数均呈先上升后下降趋势；生芽、生根所需时间则呈先下降后上升趋势。比较愈伤组织的脱分化及再分化的趋势线发现，两者都与大蒜收获后的贮藏时间密切相关，不同之处在于外植体脱分化诱导愈伤组织受大蒜鳞茎贮藏时间的影响较大。大蒜外植体再分化过程中的决定因素是愈伤组织的发育情况，例如黄色及淡黄色致密愈伤组织都可诱导出绿色芽点进而诱导出不定芽，白色疏松愈伤组织则不可以，此外胚性愈伤组织更有可能发育成为一株完整的植株。胚性愈伤组织的诱导率与作为外植体的大蒜鳞芽的生理生化状态有关（李志勇，2000）；随着贮藏时间的延长，大蒜的可溶性固形物、VC含量等都不断减少，直至VC含量降至0（李瑜 等，2008），大蒜胚性愈伤组织诱导率也随之降低。

研究收获后贮藏时间对外植体直接诱导不定芽的影响发现，不定芽发芽率、平均发芽数呈先上升后下降趋势；不定芽萌发所需时间呈先下降后上升趋势。经比较，大蒜外植体经愈伤组织途径诱导植株再生受贮藏时间影响较大。愈伤组织在经过长时间培养后由于营养物质的消耗及次生物质的代谢使生长环境越来越恶劣，增加了体细胞无性系变异及玻璃化苗出现的几率（向凤宁 等，1994；张恩让，2003；张恩让 等，2004），而由外植体直接诱导不定芽可避免这一情况的发生。此外，愈伤组织诱导不定芽发芽率受条件影响较大，不同光质条件（马琳，2010）、不同组织培养条件（李志勇，2000）均对愈伤组织内含物有影响。

利用组织培养诱导金乡大蒜植株再生的最佳时期是收获后贮藏61 d（即8月大蒜打破休眠）至122 d（即幼芽萌动期），大蒜鳞茎营养物质充足，酶活性较高，是大蒜微繁扩繁的最佳时期。随着大蒜鳞茎内幼芽的不断生长，通过外植体—脱分化—再分化—再生植株的路线培育大蒜植株的增殖系数逐渐降低。

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