HPLC 法测定抗病毒口服液中苦参碱的含量

2012-08-06刘永胜陈华金伟华范敏成都军区总医院药剂科成都60083成都医学院药学系成都60083

中国药房 2012年4期

刘永胜，陈华，金伟华，范敏（.成都军区总医院药剂科，成都60083；.成都医学院药学系，成都60083）

抗病毒口服液[1]是我科根据《中国人民解放军医疗机构制剂规范》研制的中药制剂，由山豆根、鱼腥草、板蓝根、青蒿、白芷、忍冬藤等组成。临床上主要用于治疗病毒性感冒，疗效确切。山豆根是该口服液的主药，来源于豆科植物越南槐（Sophora tonkinens Gapnep）的干燥根及根茎，具有清热解毒、消肿利咽的功效，用于火毒蕴结、咽喉肿痛、齿龈肿痛的治疗，为常用中药，其主要化学成分为生物碱、黄酮和多糖等物质，其中生物碱在医学上广泛应用。苦参碱是山豆根的主要成分，具有多种药理活性。为更好控制该制剂的产品质量和提高其药品标准水平，笔者对其中的主要成分苦参碱含量测定方法进行了试验研究。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱（HPLC）仪，包括四元泵、可变波长检测器、Agilent 1200型化学工作站（美国安捷伦公司）；DU 730型紫外-可见分光光度计（美国贝克曼公司）；AL 204型电子天平（梅特勒-托利多仪器公司）；AP-01P型真空泵（天津奥特赛恩斯仪器公司）；SZ-97型自动三重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）。

抗病毒口服液（成都军区总医院自制，10 mL/支×10瓶/盒，批号：110321A、110321B、110321C）；苦参碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110805-200507）；水为三重蒸馏水，乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Eclipse XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-磷酸盐缓冲液（pH 6.8，V/V＝25∶75）；流速：1.0 mL·min－1；柱温：30 ℃；检测波长：210 nm；进样量：10 μL。理论板数按苦参碱计算不得低于2 000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的苦参碱对照品适量，加甲醇溶解并稀释成苦参碱对照品贮备液（0.90 mg·mL－1），再精密量取适量，制成每1 mL含苦参碱0.09 mg的溶液，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备精密量取抗病毒口服液20 mL，置于分液漏斗中，精密加入三氯甲烷20 mL，浓氨试液0.5 mL，摇匀，静置至溶液分层，取下层液体，再重复上述操作2次。合并下层液体，转移至蒸发皿中，40℃挥干，残渣加甲醇适量使溶解，并转移至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备按处方比例配成缺山豆根药材的阴性样品，照“2.1.2”项下方法制备，取阴性对照液20 mL，置于分液漏斗中，用三氯甲烷萃取，过滤，干燥，即得。

2.3 系统适用性试验

精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL，注入HPLC仪测定，色谱见图1。结果，阴性对照溶液在与苦参碱对照品溶液相对应的保留时间位置上未见吸收峰，说明阴性对照溶液无干扰。

图1 高效液相色谱图A.对照品；B.阴性对照；C.供试品；1.苦参碱Fig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.negative sample；C.sample；1.martine

2.4 线性关系考察

分别精密量取苦参碱对照品贮备液（0.90 mg·mL－1）适量，加甲醇稀释制成浓度0.18、0.09、0.036、0.018、0.009 mg·mL－1的溶液。分别精密吸取10 μL，注入HPLC仪，按“2.1”项下色谱条件记录色谱图。以苦参碱检测浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，得回归方程Y＝28 120X+64.207（r＝0.999 6）。结果表明，苦参碱检测浓度在0.009～0.18 mg·mL－1浓度范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取浓度为0.090 mg·mL－1的对照品溶液10 μL，连续进样6次，测定苦参碱峰面积。结果，苦参碱对照品峰面积RSD＝1.06%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一批号样品适量，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，室温放置，于0、2、4、6、8、10 h分别进样测定其峰面积。结果，苦参碱峰面积RSD＝1.47%（n＝3），表明样品溶液在10 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同一批号样品适量，精密称取6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，重复平行测定。结果，苦参碱平均含量为0.011 mg·mL－1，RSD＝1.68%（n＝6），表明重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取同一批号（批号：101012，含量：0.115 3 mg）样品约10 mL，各6份，在苦参碱线性关系的浓度范围内，按供试样品苦参碱原有含量约1∶1的比例，分别加入苦参碱对照品0.090 mg，再按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别测定苦参碱含量，并计算各自加样回收率，结果见表1。

2.9 样品含量测定

精密称取3批供试品适量，按“2.1.2”项下方法制备成供试液，分别测定其苦参碱含量。结果，3个批号的供试品苦参碱含量分别为 0.011 53、0.011 89、0.011 75 mg·mL－1，RSD＝1.32%，表明供试样品苦参碱含量稳定，样品生产工艺成熟、稳定、可靠。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1Results of recovery test（n＝6）

3 讨论

3.1 色谱柱选择[2，3]

对于生物碱的HPLC法分析，通常采用离子对色谱，但平衡时间较长，不利于快速分析。2005年版《中国药典》中采用氨基柱，能同时分析苦参碱和氧化苦参碱，但氨基柱不常用，且稳定性稍差。因此，笔者选择了实验室常用的耐高pH的C18柱。

3.2 测定波长选择

根据参考文献资料[4，5]和苦参碱的理化性质对检测波长进行选择，取苦参碱对照品溶液，在200～400 nm波长范围内进行扫描，结果在205～207 nm波长处苦参碱有较强的吸收，最大吸收波长为206.8 nm，但是206.8 nm波长靠近紫外末端吸收区，干扰较大，影响苦参碱的含量测定。经验证210 nm波长比较合适，干扰小且灵敏度高，吸收度能达到最大吸收波长206.8 nm的98.5%，故将苦参碱含量测定的检测波长定为210 nm。