郭晶晶 单立冬 吴 钢

1.上海复旦大学附属华山医院宝山分院普外科，上海 200431；2.苏州大学医学部基础医学与生物科学学院神经生物学与医学心理学系，江苏 苏州 215123；3.上海复旦大学附属华山医院普外科，上海 200040

5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU）是胸腺嘧啶核苷的类似物，在细胞周期的S期掺入到增殖或分裂细胞的核内，只要细胞不消亡，BrdU将永久地存留在胞核DNA中，且在体或离体都能通过免疫组织化学的方法检测到，可用于标记BrdU暴露期间进行DNA合成的细胞[1]。故BrdU阳性细胞可被看作是具有增殖活性的细胞。

1 材料与方法

1.1 材料

动物：SD大鼠，雌雄不拘，体重220～230 g，苏州大学实验动物中心提供。试剂：BrdU（Roche Diagnostic Co.）。

1.2 分组

踏转轮运动对成年大鼠海马齿状回细胞增殖的影响。实验分两组，①踏转轮运动组：转轮速度为10 m/min，每天训练2 次（09:00，15:00），每次训练 30 min，连续 6 d；②对照组：动物置于转轮中，速度为0。放置次数与时间同运动组。在染色过程中每一组又分为三个亚组，分别为加入羊血清组、胰酶抑制剂组和牛血清白蛋白组。

1.3 BrdU标记

踏转轮运动的第4天开始给药，于每次运动前1 h腹腔注射 BrdU（50 mg/kg，美国 ROCHE 公司），2 次/d，连续 3 d。 末次给药后24 h处死动物，从前囟后3.3～5.1 mm作连续冰冻切片，进行BrdU染色。

1.4 BrdU免疫组织化学

切片经2 mol/L HCl（室温30 min）变性，用0.01 mol/L PBS充分漂洗后转入0.1%胰酶中（37℃15 min）消化后，0.01 mol/L PBS漂洗（5 min×3次），分别加入羊血清组、胰酶抑制剂组和牛血清白蛋白组，室温下30 min,然后加入小鼠抗BrdU单克隆抗体（1∶200，Biosource）室温孵育 16h，0.01mol/L PBS 漂洗（5min×3次），转入羊抗小鼠二抗（1∶200，Vector）室温孵育 2 h，再用 0.01 mol/L PBS漂洗（5 min×3次），移入亲和素生物素试剂（avidin-biotin complex，ABC，1∶200）室温孵育 2 h，最后用含0.03%H2O2的0.05%DAB 显色 3～5 min，0.01 mol/L PBS终止显色。……