单菌和混菌固态发酵三七渣生产蛋白饲料的动力学比较

2012-07-12成都信息工程学院资源环境学院谭显东段娅宁王君君羊依金

中国饲料 2012年17期

成都信息工程学院资源环境学院谭显东段娅宁王君君羊依金

通过固态发酵技术将中药渣转变为蛋白饲料，可以实现中药渣的完全利用，所获得的饲料产品适口性好，营养丰富，并且具有防病保健的功效（刘凤梅等，2011；谭显东等，2010、2008；秦岭等，2008；王兵等，2007；杨威，2006）。

有研究认为，混菌发酵更具有优势，一方面，混菌发酵能够充分利用不同菌株基因产物，完成单个菌种难以完成的复杂代谢作用；另一方面，酶促作用生成的糖立即被发酵糖的微生物所利用，因此有利于维持降解产物较低的浓度，消除降解产物对酶合成的阻遏作用和反应终产物对酶的反馈抑制，缩短发酵过程（邱立友，2008；陈洪章和徐建，2004）。为了考察酵母菌的加入对康宁木霉发酵三七渣的影响，试验采用康宁木霉/热带假丝酵母对其进行混菌发酵，分析其发酵动力学过程，并将混菌发酵过程与单菌发酵过程进行比较。

1 材料与方法

1.1 菌种康宁木霉（Trichoderma koningii 3.2774）由四川大学建筑与环境学院提供；热带假丝酵母（Candida tropicalis）由河北科技大学生物科学与工程学院提供。

1.2 培养基 PDA培养基：马铃薯浸取液1.0 L，葡萄糖20.0 g，琼脂15.0 g，pH自然，121℃灭菌20 min，用于康宁木霉的培养；土豆汁培养基：土豆汁1.0 L，葡萄糖20.0 g，pH自然，121℃灭菌20 min，用于热带假丝酵母的培养。除特别说明外，本试验所用固态培养基组成为：过60目筛的三七渣 10.0 g，固液比为 1∶2，（NH4）2SO40.5 g，KH2PO40.02 g，K2HPO40.025 g，MgSO40.005 g，NaCl 0.005 g。初始pH自然，121℃灭菌30 min，用于固态发酵试验。

1.3 三七渣三七渣由四川省某中成药厂提统供，湿物料经烘干、粉碎、过60目筛后置于干燥器中备用。本试验所用药渣中主要成分含量如下：淀粉33.13%，粗蛋白质12.28%，真蛋白质9.97%，还原糖0.35%。本文中若无特别说明，药渣质量均以绝干物料计量。

1.4 种子液康宁木霉采用PDA平板培养基在30℃下恒温培养3～3.5 d后刮下，将其制成浓度为2×107个/mL的孢子悬液；热带假丝酵母采用土豆汁培养基在30℃下恒温培养约16 h，制成浓度为2×107个/mL的菌悬液。接种量定义如下：10 g三七渣培养基中接入1 mL菌悬液（或孢子悬液），称为10%的接种量，依此类推。

1.5 试验方法

1.5.1 固态发酵法康宁木霉纯种发酵：取若干个容量为250 mL的锥形瓶，每个锥形瓶中装入含10 g三七渣的固态发酵培养基，将其高温灭菌冷却后接入1 mL康宁木霉孢子悬液，然后进行恒温培养：培养温度为30℃，培养时间为10 d。试验开始后每隔12 h按次序取出其中的部分锥形瓶用于分析测试发酵培养物的pH、淀粉酶活、干重、淀粉含量、粗蛋白质含量、真蛋白含量、还原糖含量、总糖含量。康宁木霉/热带假丝酵母混菌发酵：除了接种条件（先接入1 mL康宁木霉孢子悬液，恒温培养24 h后再接入1 mL的热带假丝酵母菌悬液）与康宁木霉纯种发酵过程有所区别外，其余过程均相同的；试验结果为3个平行样试验结果的平均值。

1.5.2 分析方法粗蛋白质的测定：采用凯氏定氮法测定（张丽英，2010）；真蛋白质的测定：发酵样品先进行醇洗去除其中的无机氮（胡艳丽和王克然，2007），再采用凯氏定氮法测定（张丽英，2010）。还原糖、总糖的测定：采用3，5-二硝基水杨酸法（俞建瑛等，2005）；粗酶液的提取与酶活的测定：准确称取1.00 g发酵培养物（湿基），将其溶于pH为4.6的50 mL 0.2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液中，在40℃恒温空气浴中振荡浸提1 h，然后经四层纱布过滤后，将滤液在5000 r/min条件下离心10 min，取上清液制成粗酶液，置于冰箱中待用。淀粉酶活力参照（陈毓荃2002）提供的方法进行测定；淀粉的测定：酸水解法（中华人民共和国卫生部、中国国家标准化管理委员会，2009）。

2 结果与讨论

2.1 真蛋白质含量的动态变化由图1可知，发酵过程中发酵培养物真蛋白质含量的变化大致可以分为三个阶段：第一个阶段：发酵0～24 h期间，真蛋白质含量几乎无变化；第二个阶段：发酵24～72 h期间，真蛋白质含量增长迅速；第三个阶段：发酵72～192 h期间，真蛋白质含量增长缓慢，特别是在168～192 h，真蛋白质含量基本无变化。在发酵0～144 h期间，混菌发酵体系与单菌发酵体系的真蛋白质含量基本相同；在发酵末期（156～192 h），单菌发酵体系的真蛋白质含量比混菌发酵体系要高出近两2百分点。

图1 发酵培养物真蛋白质含量的动态变化

2.2 产品收率的动态变化由图2可知，随发酵时间的延长产品收率不断下降。在发酵0～108 h期间，产品收率下降较快；在发酵156～192 h期间，产品收率几乎不再变化，并且混菌发酵体系的产品收率比单菌发酵体系高出大约3个百分点。

2.3 还原糖和总糖含量的动态变化由图3可知，发酵过程中总糖含量不断降低，还原糖含量先升高，到达峰值后又逐渐下降。混菌发酵体系还原糖含量先于单菌发酵体系达到峰值，并且混菌体系的峰值略高于单菌体系；在发酵12～84 h期间，混菌发酵体系的总糖含量低于单菌发酵系统，说明酵母菌的加入在发酵前期可以促进总糖的消耗，提高还原糖生成的速率。

2.4 pH的动态变化由图4可知，单菌发酵系统和混菌发酵系统的pH下降趋势基本一致，但是在发酵36～72 h期间混菌发酵体系的pH明显低于单菌发酵体系，这与发酵前期酵母菌对总糖代谢的促进作用相关。

2.5 淀粉酶活力的动态变化由图5可知，发酵初期（0～36 h），单菌和混菌发酵体系的淀粉酶活力均比较低，且差距不大；此后，单菌体系的酶活力均要高于混菌体系。原因可能是发酵初期，生物量相对较少，体系中的营养组分能够同时满足多种微生物生长的需要，但是到了发酵中后期，随着生物量的增加，混菌体系中酵母菌会与康宁木霉竞争有限的营养物质，从而在一定程度上影响康宁木霉的生长和产酶。