解放军第323医院干三科（西安710054） 刘秋平 卢晓昭 费晋秀 王黎明 王常利 赵亚玲 王 娟

骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells， MSC）是成体干细胞的一种，其中骨髓间充质干细胞在有核细胞中只占0.001%～0.01%［1］，在一定条件下可分化为多个胚层来源的组织细胞［2］。因此，干细胞移植有可替代受损细胞，成为治疗多种疾病的有效方法。急性肺水肿见于多种疾病引发的并发症，是多种发病机理的综合效应，是内科急危重症。本研究应用氯化铵诱导建立大鼠急性肺水肿模型，观察骨髓间充质干细胞预防性移植及治疗性移植对肺水肿病理学变化影响，为急性肺水肿预防治疗提供实验依据。

材料与方法

1 实验材料

1.1 SD大鼠骨髓间充质干细胞 购买广州赛业生物科技有限公司的已分离、培养并鉴定的SD大鼠二代骨髓间质干细胞1×106，复苏传代后取4～6代大鼠MSCs，计数稀释至1×105／只抽入1ml注射器备用。

1.2 实验动物 健康SD大鼠80只，雌性，体重185±15g，购自第四军医大学实验动物中心。

2. 实验方法

2.1 实验动物及分组 SD雌性大鼠80只，随机分为5组，每组16只。①肺水肿组：腹腔注射6%NH4Cl 0.4ml／100g；②干细胞治疗组：腹腔注射氯化铵同肺水肿组，30min后尾静脉注射干细胞1×106／只。③干细胞预防组：尾静脉注射干细胞1×106／只，30min后腹腔注射相同剂量氯化铵。④干细胞对照组：8只腹腔注射氯化铵同肺水肿组，30min后尾静脉注射等量生理盐水；另8只尾静脉注射等量生理盐水，30min后尾腹腔注射同剂量氯化铵。⑤空白对照组：8只腹腔注射等量生理盐水，30min后尾静脉注射等量无血清DMEM；另8只尾静脉注射等量无血清DMEM，30min后腹腔等量生理盐水。

2.2 肺重系数计算（肺重系数＝肺重量g／体重g×100% ）各组动物分别在上述处理后30min、2h、1d、7d时间点快速处死4只动物，将肺及心脏一起取出，剪除心脏及脂肪组织，用滤纸吸去肺表面液体，用天平称两肺重量，计算肺重系数。若肺重系数＞1%，证明肺水肿形成。

2.3 组织病理学观察 分别对每只肺称重后的左肺组织用10%甲醛组织固定，石蜡包埋切片HE染色。

2.4 扫描电镜观察 对各组每个时间点死的动物选取1只肺称重后的右肺组织，修剪成1cm×1cm大小组织片，放入3%的戊二醛固定液进行前固定，4℃冰箱内2h以上，0.1mol／L PBS漂洗，用500，750，1000ml／L乙月青梯度脱水，JEE－4X真空蒸发仪真空干燥，JEC－I100离子溅射仪喷金处理；HITACHIS－3400N扫描电镜下观察。

3 统计学处理 本组所有数据采用SPSS12.0统计学软件进行处理，对数据进行方差分析，以均数±标准差（¯x±s）表示，P＜0.05为有显著性差异，P＞0.01为有极显著性差异。

结 果

1 肺重系数 见附表。肺水肿组、干细胞治疗组、干细胞预防组肺重系数在注射氯化铵后的在各时间点（30min，2h，1d，7d）与相应对照组进行比较，各组在2h时间点的肺重系数与对照组比较有显著差异（P＜0.05），其余时间点无显著性差异（P＞0.05）。干细胞治疗组在各时间点（30min，2h，1d，7d）的肺重系数与肺水肿组的比较，干细胞治疗组在2h时间点的肺重系数有显著差异（P＜0.05），其余时间点无显著性差异（P＞0.05）。干细胞预防组在各时间点肺重系数与肺水肿组的比较无显著性差异（P＞0.05）。

附表 干细胞治疗／预防对大鼠肺重系数的影响（¯x±s）

2 肺组织光镜病理学变化 见图1～7。正常肺组织肺泡腔结构正常，无渗出物，肺泡壁毛细血管无充血。肺水肿组，腹腔氯化铵注射30min时肺泡壁毛细血管轻度充血，肺泡腔出现少许粉红色渗出物，2h肺泡腔大量渗出物，肺泡壁毛细血管明显充血。1d，7d时部分肺泡壁增厚，肺泡腔无明显渗出。干细胞治疗组在30min时肺组织结构基本正常，2h时可见肺泡壁少许充血。1d，7d时肺泡壁、肺泡腔组织结构恢复正常。干细胞预防组肺组织病理学变化各个时间点基本与肺水肿组相同。

图1 对照组肺泡腔结构正常，无渗出物，肺泡壁毛细血管无充血（HE×400）

图2 肺水肿组30min时肺组织结构基本正常或肺泡腔出现少许粉红色渗出物（HE×400）

图3 肺水肿组2h时肺泡腔大量渗出物，肺泡壁毛细血管明显充血（HE×400）

图4 肺水肿组1d，7d时部分肺泡壁增厚，肺泡腔无明显渗出（HE×400）

图5 干细胞治疗组在30min时肺组织结构基本正常（HE×400）

图6 干细胞治疗组2h时可见肺泡壁少许充血（HE×400）

3 肺组织电镜下病理学变化 见图8～11。对各组2h的肺组织进行扫描电镜观察，肺水肿组肺泡腔明显扩大，Ⅱ型肺泡细胞结构不规整，可见少量红细胞。干细胞治疗组肺泡腔扩大，Ⅱ型细胞结构尚可，少许Ⅱ型细胞细胞脱落到肺泡腔。干细胞预防组肺泡腔扩大，肺泡腔内可见少量红细胞，Ⅱ型细胞结构尚可，分泌颗粒有排空现象。对照组肺泡腔较小（正常），无红细胞，Ⅱ型细胞结构完整，板层小体结构完整。

图7 干细胞治疗组7d肺泡壁、肺泡腔组织结构恢复正常（HE×400）

图8 肺水肿组在2h时肺泡腔明显扩大，Ⅱ型肺泡细胞结构不规整，可见少量红细胞 （×12K）

图9 干细胞治疗组在2h时，肺泡腔扩大，Ⅱ型细胞结构尚可，少许Ⅱ型细胞细胞脱落到肺泡腔（×12K）

讨 论

成人肺干细胞在正常状态下增殖十分缓慢，当肺组织受损后通常通过局部的更新加快来修复维持细胞的状态，但增殖潜能低，修复效果十分有限。除肺自身存在的干细胞，骨髓干细胞，包括骨髓间充质干细胞内可见少量红细胞，Ⅱ型细胞结构尚可，分泌颗粒有排空现象（×12K）（MSCs）和造血干细胞，也可以进入“归巢”受损肺组织，转化为肺内细胞。Rojas等［3］将 MSCs移植到博莱霉素诱导的肺损伤小鼠体内，发现输入体内的MSCs能定向迁移到肺损伤区域并分化为特定的肺细胞表型。MSCs移植后在肺损伤动物模型中的抗炎效应和免疫调节功能也得到进一步认识，陈莉娜等［4］研究发现，MSCs具有免疫调节作用。进一步深入研究发现［5］，受损的肺细胞能诱导MSCs的迁移，MSCs参与受损肺细胞内调节炎症信号过程。

图10 干细胞预防组在2h时，肺泡腔扩大，肺泡腔

图11 对照组2h时肺泡腔较小（正常），无红细胞，Ⅱ型细胞结构完整，板层小体结构完整（×12K）

本实验研究发现，无论从各时间点肺重系数或是光镜组织病理学观察，6%氯化铵腹腔注射复制的大鼠肺水肿模型在2h时间点时，肺水肿表现最为显著，肺泡腔可见大量渗出物，肺泡壁毛细血管明显充血，在1d和7d时小部分肺组织出现纤维化表现。干细胞治疗组在各时间点肺水肿病理学表现较肺水肿组明显减轻，而干细胞预防组在各时间点其肺组织病理学表现与肺水肿组相近。通过电子显微镜对动物模型2h时间点超微结构的观察，肺水肿组肺泡腔明显扩大，Ⅱ型肺泡细胞结构不规整，可见少量红细胞。干细胞治疗组可见肺泡腔扩大，未见红细胞，Ⅱ型细胞结构尚可，少许Ⅱ型细胞细胞脱落到肺泡腔。干细胞预防组肺泡腔扩大，肺泡腔内可见少量红细胞，Ⅱ型细胞结构尚可，分泌颗粒有排空现象。对照组肺泡腔较小（正常），无红细胞，Ⅱ型细胞结构完整，板层小体结构完整。

急性肺水肿是体液在肺间质或肺泡内积聚，大多数是由于肺毛细血管通透性增加或毛细血管内压升高所致，很多因素可以引起肺水肿，其发生的病理学说颇多，其中腹腔注射氯化铵是诱发肺水肿模型是一种经典的方法。本实验通过对肺水肿模型进行预防性干细胞移植及治疗性干细胞移植，发现治疗性干细胞移植能明显减轻肺重系数及组织病理学改变，在急性期减轻，在恢复期未发现纤维化改变。而预防性移植组均对肺重系数及组织病理学改变急性期及恢复期无减轻，说明干细胞能移植作为对急性肺水肿治疗方法，而不能作为肺水肿防护措施。这与干细胞得到肺组织受损的“信号”后，才能迅速“集结”并“归巢“受损肺组织，修复肺组织理论一致。本实验的结果为急性肺水肿救治及防护提供实验学依据。

［1］ Pittenge MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilneage potential of adult human mesenchymal stem cell［J］.Science，1999，284（5411）：143－145.

［2］ Prockop DJ.Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissue［J］.Science，1997，276（5309）：71－73.

［3］ Rojas M，Xu J，Woods CR，et al.Bone marrow－derived mesenchymal stem cells in repair of the injured lung［J］.Am J Repair Cell Molbiol，2005，33（2）：145－152.

［4］ 陈莉娜，王 颖，张艳艳，等.间充质干细胞的免疫调节作用［J］.中国组织工程研究与临床康复，2007，11（28）：5626－5629.

［5］ Iyer S，Rojas M.Anti－inflammatory effects of mesenchymal stem cells：novel Concept for future therapies［J］.Expert Opin Biol Ther，2008，8（5）：569－581.