西安交通大学医学院第二附属医院骨二科（西安710004） 臧全金 历 强 朱振中 贺西京

星形胶质细胞（Astrocytes，AST）在中枢神经系统中具有稳定神经元结构、营养支持神经突触微环境物质代谢及参与血脑屏障形成的作用［1］。同时，AST可以通过分泌递质调节神经元的活动，参与神经系统的信息整合和信号传导［2，3］。最新研究发现侧脑室下区和海马齿状回的神经干细胞其本质可能就是局部的AST［4，5］，从而引起人们对该区域神经干细胞特性研究的重视。目前体外研究的AST均来源于胚胎以及新生动物，其与成年动物AST在生物学特性及功能上存在较大差异，不能成为理想的细胞来源。而成年动物的AST已经高度分化成熟，在体外培养情况下难以存活，即使存活其纯度也不能令人满意。文献报道的用于研究的AST纯度为75%，其中主要混杂的是成纤维细胞［6］。因此，有必要探索成年哺乳动物侧脑室下区AST培养纯化方法，为体外深入研究成年哺乳动物中枢神经系统AST细胞特性以及以后临床应用提供参考。

材料与方法

1 实验材料 成年SD大鼠200～250g，≥2.5月，雌雄不限，由西安交通大学医学实验动物中心提供；胎牛血清（FBS）、DMEM／F12培养基（DF12）、胰蛋白酶、B27添加剂购自 Gibco公司；EDTA、Poly－L－lysine、牛血清白蛋白（BSA）购自Sigma公司；小鼠抗大鼠GFAP单克隆抗体（mAb）购自Chemicon公司；Hoechest33342、抗兔FITC偶联荧光二抗购自Molecular Probe公司；Leica倒置相差显微镜购自Leica公司；Olympus BX51型荧光显微镜及FV1000型激光共聚焦显微镜购自Olympus公司。

2 实验方法

2.1 成年大鼠室下区的取材及培养 按照Alvarez－Buylla方法［7］取材成年大鼠侧脑室下区。将获取的室下区脑组织剪碎后加入适量1.25g／L胰酶＋0.02g／L EDTA，置于37℃培养箱消化25min后加入适量血清中止消化。D－Hanks液漂洗后用火焰抛光的Pasteur管吹打并过200目滤网制成单细胞悬液。将细胞接种于Poly－L－lysine预处理的25cm2塑料培养瓶中，置于50ml／L CO2、37℃孵箱中培养30 min。取出后晃动培养瓶至显微镜下观察见只有少数展开细胞贴壁时将细胞悬液吸出，离心后移入DF12＋10ml／L FBS＋2g／L B27培养基中，在相差显微镜下进行活细胞计数，调整细胞密度至1×108／L后接种于Poly－L－lysine预处理的塑料培养瓶或者培养皿中，37℃培养箱中培养。实验组细胞接种后第3天全量换液将培养液改为DF12＋2ml／L FBS＋2g／L B27，然后按照隔日半量换液，培养至7～9d时将培养液改为DF12＋5ml／L FBS＋2g／L B27。对照采用非低浓度血清，培养液为DF12＋10ml／L FBS＋2g／L B27；非血清调整组：培养液DF12＋5ml／L FBS＋2g／L B27，对照组每隔两天常规换液。定期于Olympus倒置相差显微镜下观察并比较不同时期AST形态结构的变化。

2.2 AST的免疫细胞化学鉴定和纯度检测将培养14～15d的AST细胞用预温的0.01mol／L PBS清洗2次，然后用40g／L多聚甲醛溶液固定25～30min，0.01mol／L PBS清洗3次。加入 10g／L BSA封闭1h，弃去封闭液加入抗大鼠GFAP mAb（1∶1000）。4℃孵育24h。然后用0.01mol／L PBS清洗3次，每次10min，加入FITC结合荧光二抗（1∶400）室温作用3h，0.01mol／L PBS清洗3次，每次10min，最后加入 Hoechest 33342（100g／L）作用20 min，常规PBS清洗后用60%甘油封片。同时设立阴性对照组，用10g／L BSA代替一抗。于BX51型O－lympus荧光显微镜下观察阳性细胞着色情况并且计算细胞的纯度。方法：在200倍镜下随机选择15个视野在488nm激发光下进行FITC阳性细胞计数，同时在405nm激发光下计数相同视野内的所有Hoechst 33342阳性细胞核数量。细胞纯度为相同视野下FITC阳性细胞占所有Hoechst 33342阳性细胞核数的比值，独立实验重复3次后求平均值。

结 果

1 形态学显示 细胞接种后2h绝大部分细胞贴壁，呈圆形或类圆形，折光性强，大小较一致。此时，视野中可见折光性较弱的细胞碎片，未见明显的成纤维细胞（见图1A）；实验组及非血清调整组细胞生长至第4天，出现了少量的较为典型的AST样集落，以纤维型AST为主，细胞多呈双极或三极条索样排列；偶可见极少量的成纤维细胞集落（见图1B），而此时非低浓度血清组出现大量的成纤维细胞集落，呈梭状，放射状排列；6d时，实验组及非血清调整组原有的AST样集落进一步增大，集落中细胞可见原浆型AST增多，集落由条索状转变为片状。可见少量的成纤维细胞及空泡状的小胶质细胞混杂（见图1C），此时非低浓度血清组成纤维细胞大量增殖，铺满瓶底，仅可见极少数AST样集落，此状态维持至实验结束；9d时，前两组原有的AST样集落继续增大，集落间细胞出现不同程度的交织，连接成网状，集落中成纤维型／原浆型AST比例与前相似，总体生长速度较为稳定。此时小胶质细胞、少突胶质细胞及成纤维细胞较前增多，可见少量成纤维细胞集落（见图1D），以非血清调整组为多；培养9～12d时，细胞生长速度明显增快，原来呈网格状连接的AST集落汇集成片状，以原浆型AST为主。小胶质细胞出现不同程度的脱落，成片状漂浮于培养基上（见图1E），视野中空泡状的小胶质细胞数量下降。成纤维细胞集落增长不明显；培养至14d时，培养瓶底部铺满AST，细胞多呈圆形或类圆形，以原浆型占多数，折光性不强。胞体大、胞质丰富，胞突较多。此时，小胶质细胞及少突胶质细胞的比例明显下降，细胞总体纯度较高（见图1F）。

2 免疫细胞化学显示 非低浓度血清组培养至6d时大量成纤维细胞增殖，仅有极少量散在分布的AST样集落。实验组及非血清调整组AST经GFAP免疫细胞化学染色后绝大部分呈GFAP阳性染色，成纤维细胞数量较少，胞体未着色。荧光显微镜下可见AST呈纤维状聚集或类圆形散在生长（见图2A），细胞胞质着色较深，高倍视野下细胞骨架形态清晰可见（见图2B），细胞核未着色而呈空泡样。对照组胞质部分未见明显的阳性着色，只有模糊的非特异性背景着色，没有明显的细胞核空缺区（见图2C）。按照上述方法在200倍视野下随机选取15个视野，计算GFAP阳性着色细胞占所有细胞的比例，非低浓度血清组、非血清调整组、实验组细胞纯度分别为28%，74%，91%。提示低浓度血清结合血清浓度调整法是一种有效的纯化成年AST的方法。

图1 星形胶质细胞镜下形态学显示

图2 星形胶质细胞GFAP免疫组化染色

讨 论

星形胶质细胞具有神经干细胞特性的发现为神经系统疾病的治疗提供了新的思路。目前，体外培养AST多来源于胚胎或者新生哺乳动物，采用Mccarthy介绍的DF12＋10ml／L FBS培养基、37℃恒温摇床法进行纯化。但是，胚胎本身的幼稚性并不能准确地反映成年动物AST的特性。同时，胚胎或者新生动物来源的AST数量多、增殖快，成纤维细胞的污染较少。成年动物侧脑室下区取材量较少，细胞在体外的增殖速度慢，其中最突出的问题是成纤维细胞的污染。因此，在成年哺乳动物AST培养的过程中要选择适当纯化方法，既能使AST生长、增殖，又能最大限度地去除或抑制成纤维细胞的生长。

目前抑制成纤维细胞生长的方法主要有阿糖胞苷及Thy1.1－补体杀伤法，但是这些方法对AST活性损伤较大，不利于细胞生长、增殖。差速贴壁法是一种利用神经胶质细胞与成纤维细胞贴壁速度存在明显差异的特性，去除先贴壁的成纤维细胞的纯化方法［8］，具有操作简单、重复性好及费用低等优点。然而我们在实验过程中发现，用差速贴壁法纯化培养AST的具体差速时间难以准确把握，存在差速时间不足造成混杂细胞较多或差速过长导致细胞损失量较大的缺点，并不能有效地去除AST培养过程中混杂的成纤维细胞。B27添加剂中富含多种神经细胞赖以生长的营养物质。单独的B27添加剂可以作为神经元培养的无血清限定性培养液，其对神经系统其他细胞或细胞系的生长、增殖亦有着良好的促进作用，效果甚至可以和胶质细胞限定性G5培养基相当［9］。因此在培养的过程中，我们首先采用差速贴壁法初步去除成纤维细胞，然后以B27添加剂结合低浓度血清调整的方法对AST进行纯化。

体外培养的成纤维细胞及AST对血清均有明显的生长依赖性，而培养早期成纤维细胞对血清的依赖性更强［10］。因此，根据这两种细胞自身的增殖特点和对血清的依赖性生长特性及时调整血清浓度十分关键。研究证实在10ml／L血清浓度下体外培养的AST，7～9d进入增殖期，而成纤维细胞2～3d即进入对数生长期。但在2.5ml／L血清浓度时，成纤维细胞生长速度则明显下降［11］。本实验细胞接种时采用10ml／L血清浓度旨在提高接种细胞的成活率。当培养至第3天时将血清浓度降至2.5ml／L，在此血清浓度下成纤维细胞由于缺乏营养而不能大量增殖，此时AST在B27添加剂以及少量血清的作用下得以存活。待细胞培养至第9天，即AST进入生长高峰期时提高血清浓度至5ml／L，此血清浓度尚不足以引起成纤维细胞的大量增殖，而AST在B27添加剂的共同作用下分裂增殖明显增加。待AST增殖铺满培养瓶底部时，由于AST高密度对成纤维细胞增殖也有一定的抑制作用从而获得纯度较高的AST。

本研究为体外深入研究成年哺乳动物中枢神经系统AST的神经干细胞生物学特性、探索中枢神经干细胞来源、分布以及以后临床应用提供了参考，为成熟后神经重塑机制的研究提供了实验依据。

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