姚柏春 孙天敏 冯 娜 王 军 唐慕湘 王金勇 王配军

(湖北医药学院，湖北 十堰 442000)

临床治疗阿尔茨海默病(AD)主要是改善患者学习记忆功能，无法补充大脑皮层、基底前脑和海马大量丢失的神经元、神经突触和神经递质。已有研究应用神经干细胞(NSCs)移植治疗AD，但效果不够理想〔1，2〕。本研究用嗅成鞘细胞(OECs)与NSCs共移植于AD大脑，探讨其对AD的作用，为临床有效治疗AD提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂 健康雄性SD大鼠，SPF级，7～9月龄，体重250～300 g;另孕16～18 d SD大鼠4只，均由湖北医药学院实验动物中心〔许可证号:SCXK(鄂)2005-0008〕提供。DMEM/F12、无血清培养液添加剂 B27、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、Hoechst33258、胰蛋白酶(Gibco);20%胎牛血清FBS(PAA);突触素抗体(Sigma);兔抗鼠Nestin单克隆抗体、鼠抗鼠NF200单克隆抗体(Santa Cruz);大鼠β淀粉样蛋白1-40(Aβ1～40)(Biosource);多聚赖氨酸、兔抗鼠GFAP多克隆抗体、小鼠抗大鼠P75多克隆抗体、胆碱乙酰转移酶(ChAT)抗体、羊抗鼠IgG:TRITC(武汉博士德)。

1.2 OECs培养及鉴定〔3，4〕无菌条件下剖腹取8～10只SD胎鼠(孕 16～18 d)嗅球最外二层(神经层、小球层)，经0.125%(W/v)胰蛋白酶消化和机械吹打分散成单细胞悬液，以1×106/ml细胞密度种植于含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液的25 cm2玻璃培养瓶中;在培养的第12和24小时分别进行两次差速贴壁处理;第7天加入5×10-5mol/L的阿糖胞苷(Ara-C)，作用48 h(除去成纤维细胞)后全量换液消除Ara-C的作用;加入bFGF 10 ng/ml培养5 d，扩增OECs;以后每3天半量换液一次。每天在倒置显微镜下进行形态学观察并摄片，记录细胞生长情况。第14天按照ABC法进行神经生长因子受体(NGFRp75)免疫细胞化学染色鉴定，并计算OECs的纯度;收集培养细胞(密度为1×107/ml)备用或冻存。……