王 妍 郑吉春 岳 颖 李德昌 任 力

(河北北方学院，河北 张家口 075000)

淋巴道转移乳腺癌转移的最主要途径。随着淋巴管生长因子和淋巴管内皮特异标记物的发现，肿瘤及肿瘤周围组织是否存在新生的淋巴管及其与肿瘤淋巴结转移的机制一直是研究热点。本文采用免疫组织化学技术，检测乳腺癌中D2-40标记的淋巴管密度，探讨肿瘤淋巴管形成与淋巴道转移的相关性，作为评估乳腺癌淋巴结转移的一项辅助指标，为判断乳腺癌患者预后提供实验和理论依据〔1〕。

1 材料与方法

1.1 材料 收集空军总医院病理科2003年1月至2011年5月经病理证实为乳腺癌的标本62例，5例正常乳腺组织为对照。所有病例均为女性，年龄20～81岁，中位年龄54岁，绝经前25例，绝经后37例。肿块最大直径≤2 cm 21例，2～5 cm 36例，＞5 cm 5例。所有病例术前均未进行放化疗治疗。按2003年WHO乳腺肿瘤组织学分类，均为浸润性导管癌，腋窝淋巴结转移25例，无腋淋巴结转移37例。

1.2 方法 免疫组化SP法D2-40染色标记肿瘤淋巴管。CD31，CD34染色标记肿瘤微血管。乳腺癌组织石蜡标本4μm厚连续切片，SP免疫组织化学染色，以PBS液代替一抗为阴性对照，已知阳性结肠癌组织为阳性对照(随试剂附带)。鼠抗人D2-40单克隆抗体(编号ZM-0465，即用型)，PV-9000二步法免疫组化检测试剂盒。以上试剂均购自北京中山金桥生物公司。

1.3 结果判断 淋巴管内皮细胞特异性标志物D2-40免疫组织化学染色，可见淋巴管内皮细胞膜和(或)胞浆呈棕黄色颗粒，直观显示淋巴管壁薄、形态不规则、管腔较大，内皮细胞核相对较稀疏或呈叠状。血管内皮细胞标志物CD31，CD34免疫组织化学染色阳性表达，内皮细胞与基膜均着色者判定为微血管，光镜下难以区分者暂判为微血管。先在光镜低倍(10×4)视野下寻找癌周组织淋巴管最密集区域即热点，然后在200倍视野下观察染色成棕黄色的管腔、单个细胞或成群无管腔的染色细胞及细胞丛并以此作为一个微淋巴管，计数时距离癌主质边缘超过100μm的微脉管不计入癌周微淋巴管数，管腔直径＞50μm或管壁含有肌层者不作为微淋巴管。单位面积的微淋巴管数即微淋巴管密度。观察5个200倍视野内(0.74 mm2/视野)的淋巴管数，取其平均值为微淋巴管数。计算LMVDpt的均数，大于均数的归为高LMVDpt组，低于或等于该均数的归为低LMVDpt组。

1.4 统计学方法 应用SPSS10.0统计软件进行统计学分析，采用两独立样本t检验或方差分析法。

2 结果

2.1 LMVD的分布形态和分布特点 微淋巴管的“热点”区域绝大多数位于癌巢周边部组织内，肿瘤内部间质中分布较少，在癌巢内的分布极少，本组62例乳腺浸润性导管癌癌巢组织内均未见微淋巴管。与乳腺纤维腺瘤组织相比，乳腺浸润性导管癌癌周组织淋巴管数量增多，形态不规则，管腔变薄，部分呈闭塞状态，部分扩张明显，呈条索状或丛状，围绕癌组织成环状分布，部分癌周淋巴管内可见瘤栓。见图1。

2.2 转移与未转移组LMVD比较 乳腺癌转移者与未转移者LMVD比较，两者差异有统计学意义。有腋窝淋巴结转移的乳腺浸润性导管癌LMVD pt为(16.97±4.79)，无腋窝淋巴结转移的乳腺浸润性导管癌的LMVDpt值(11.47±3.96)，有腋窝淋巴结转移组明显高于无腋窝淋巴结转移组，差异有统计学意义(P=0.004 4)。

图1 癌周淋巴管病理学改变(×100)

3 讨论

目前许多研究表明肿瘤的微血管密度与肿瘤恶性程度、血道转移、复发及预后密切相关〔3〕。淋巴管和血管伴行生长，但在结构和功能方面存在着明显的差别。肿瘤组织的LMVD可从一个侧面反映出肿瘤组织和肿瘤细胞的微环境状态，对肿瘤细胞的增殖、生长、侵袭和转移起着至关重要的作用。国外学者报道肿瘤内淋巴管数除与淋巴道转移有关外，与肿瘤恶性程度、血道转移、复发及预后密切相关，淋巴管数是评估恶性肿瘤预后独立预测因子，其意义可等同于微血管计数〔4，5〕。

光镜下观察淋巴管形态，癌巢内未发现明显的成形淋巴管，偶尔见到少数发育较差的淋巴管样结构，癌巢周围间质内淋巴管数目明显减少。癌巢边缘间质组织中可见到较丰富得发育不佳的淋巴管样结构，管腔大而扁，管壁较薄，有的部位出现较多皱褶部分，呈闭塞状态，部分扩张明显，呈条索状或丛状，围绕癌组织成环状分布，部分癌周淋巴管内可见瘤栓。和目前大部分研究结论较一致，认为原发性乳腺癌肿瘤淋巴管主要存在于肿瘤间质组织中，不同区域肿瘤间质内淋巴管的密度、管腔形状大小均不一致〔6〕。

本文提示在肿瘤发生区域淋巴结转移的过程中，瘤周淋巴管发挥了明显的作用〔7〕。文献报道LMVDpt与肿瘤最大直径、腋窝淋巴结转移数目和 pTNM分期之间有统计学关联〔8〕。

肿瘤诱导的淋巴管生成是肿瘤淋巴道转移的重要步骤。目前大多数观点认为是肿瘤组织在生长过程中能诱导血管内皮细胞生长因子系列 (包括VEGF-C和 VEGF-D)及其受体(VEGFR-2、VEGFR-3)的表达，在促进血管形成的同时还促进淋巴管的形成〔9〕。新生的淋巴管仅由单层细胞组成，无基底层，细胞间紧密连接较少，有许多潜在腔隙等，这些因素都有利于肿瘤细胞进入淋巴管〔9〕。肿瘤淋巴管生成造成淋巴管密度增加，淋巴管数目的增多使肿瘤细胞有更多的机会侵入毛细淋巴管促进乳腺癌淋巴结转移，形成淋巴道转移，影响患者预后。LMVDpt在乳腺浸润性导管癌的扩散转移中起重要作用，可作为选择乳腺浸润性导管癌治疗方式及预测其淋巴结转移及预后的重要指标。

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3 Zotota V，Gerokosta A，Melachrinou M，et al.Microvessel density，proliferating activity，p53 and bcl-2 expression insituductal carcinoma of the breast〔J〕.Anticancer Res，1999;19(4):3269.

4 Kaiserling E.Immunohistochemical identification of lymph vessels，with D2-40 in diagnostic pathology〔J〕.Pathology，2004;25(5):362-74.

5 van den Eynden GG，Van Der Auwera I，Van Laeres J，et al.Distinguishing blood and lymph vessel invasion inbreast cancer.A prospective immunohistochemical study〔J〕.Br J Cancer，2006;94(11):1643-9.

6 Leu AJ，Berk DA，Lymboussaki A，et al.Absence of functional lymphatics within a murine sarcoma:a molecular and functional evaluation〔J〕.Cancer Res，2000;60(16-18):4324-79.

7 Padera TP，Kadambi A，di Tomaso E，et al.Lymphatic metastasis in the absence of functional intratumor lymphatics〔J〕.Science(Wash DC)，2002;296:1883-6.

8 车国卫，周清华，张尚福，等.检测肺癌中的微血管密度及其临床意义〔J〕.中国肺癌杂志，2000;3(4):284-6.

9 Stacker SA，Caesar C，Baldwin ME，et al.VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics〔J〕.Nat Med，2001;7(2):186-91.