弋振营 邢月明 晋刚

(1.开封市第一人民医院肿瘤科 河南开封 475000; 2.山西医科大学第二医院肿瘤1科 太原 030001)

放疗是非小细胞肺癌的主要治疗手段之一,但放射治疗5年生存率低。本实验探讨卡培他滨联合放疗对小鼠Lewis肺癌的抑瘤效应。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

动物及模型:C57BL/6J近交系雄性小鼠48只,引自中国医学科学院实验动物中心,许可证号:SCXK(京)2004-0001。鼠龄6周,体重18～22g。

卡培他滨片:规格500mg/片,批号:SH0075。上海罗氏制药有限公司提供。

照射方法:采用北京大恒公司KB1800型医用电子直线加速器,6MV-X线进行照射,SSD为100cm,剂量率为3Gy/min。

1.2 分组及处理

移植瘤直径达1cm左右时,随机分为:4组,每组12只。(1)对照组,不做任何处理;(2)放疗组,X射线照射肿瘤局部5Gy/次×4次,隔日进行1次;(3)卡培他滨组,按60mg/(kg·d),每只小鼠每天灌胃200μL卡培他滨混悬液,连用10d;(4)卡培他滨+放疗组,放疗和卡培他滨用法用量同前。

1.3 疗效观察

每天观察荷瘤鼠活动、毛色、进食等情况。每2天用游标卡尺测量并计算肿瘤体积:V=1/6AB2π(A＞B)[1]一次。(A:肿瘤的最大长径;B:与A垂直的最大宽经),观察肿瘤的生长情况并绘制肿瘤生长曲线。

1.4 病理形态观察

放疗结束后5d,引颈脱臼处死小鼠,取肿瘤组织切片、HE染色,普通光镜下(100倍)观察肿瘤组织。

1.5 测定瘤组织微血管密度(MVD)、血管内皮生长因子(VEGF)表达阳性率:

图1 移植瘤体积生长曲线

图2 移植肿瘤组织内MVD（免疫组化x200）

图3 肿瘤组织内VEGF表达阳性率（免疫组化x400）

CD34或VEGF抗体为Ⅰ抗,SABC法免疫组化染色,具体方法根据试剂盒说明书。MVD计数按Weidner[2]的评判标准进行。低倍镜(x40)下选择5个血管最多的“热点”区域,在200倍视野下计数,每例标本计数5个视野,最后取平均值。VEGF表达阳性率:随机选取5个肿瘤外周区域,计数高倍镜(×400)下染色阳性的肿瘤细胞,阳性细胞数除以同一视野下肿瘤细胞总数,求得肿瘤细胞VEGF表达阳性率(%)[3]。

1.6 统计分析

利用SPSS13.0软件进行统计分析。计量资料以均数土标准差表示,治疗前肿瘤体积指标采用单因素方差分析,多个样本间均数比较采用析因设计方差分析。P<0.05认为差异有显著性。

2 结果

(1)治疗前各组肿瘤体积无差别(P>0.05)。随着时间的延长,各组肿瘤的体积均逐渐变大。对照组小鼠的肿瘤生长曲线最陡,各治疗组小鼠的肿瘤生长曲线变平缓,放疗+卡培他滨组曲线最平缓,说明对肿瘤抑制作用最强(图1)。

(2)实验结束后,进行移植瘤组织病理学检查,移植瘤组织内有坏死,镜下均可见癌组织,癌细胞圆形或椭圆形,核大,核仁明显,浓然,细胞大小不等,癌细胞被纤维组织分隔成大小不等的癌巢。①组癌细胞生长旺盛,坏死很少。②组内可见大片状坏死。

(3)肿瘤组织切片中,微血管多集中于肿瘤细胞浸润的边缘部位。CD34阳性染色主要位于细胞的胞浆、核膜上,为棕黄色或褐色颗粒(图2)。

VEGF主要表达于肿瘤细胞的细胞质,阳性染色的肿瘤细胞多位于浸润边缘,表现为胞浆内均匀棕黄色细颗粒状。血管内皮细胞可呈弱阳性染色(图3)。

析因设计方差分析结果:MVD的放疗因素与卡培他滨因素主效应均有统计学意义(P<0.001);VEGF放疗因素与卡培他滨因素主效应均有统计学意义(P<0.001);卡培他滨和放疗联合应用组的MVD、VEGF均数最小,即放疗与卡培他滨2种方法同时应用,肿瘤组织的MVD值、VEGF表达阳性率最低。放疗因素与卡培他滨组因素之间存在交互作用(P<0.001;P<0.05)。

3 讨论

肺癌是临床常见、病死率最高的恶性肿瘤之一,其中以非小细胞肺癌最常见。约80%肺癌病例需接受放疗或放化疗综合治疗。提高放射治疗增益比是肿瘤放射治疗的根本目标[4]。肿瘤剂量越大,肿瘤控制率就越高,但同时,对正常的组织和细胞损伤也越大。因此放疗剂量不能无限提高。

5-Fu可抑制DNA放射损伤的修复及使周期敏感细胞成分增加,从而产生良好的放疗增敏作用。但由于5-Fu的严重粘膜反应和用药的复杂性,限制了其临床应用[5]。卡培他滨是5-FU的前体药物,通过TP酶转化为5-Fu而激活。TP酶在肿瘤组织中的浓度增高,如其在肺癌中的阳性率达63.8%[6],正常肺组织无表达。这种现象有利于发挥卡培他滨的放疗增敏作用;同时有研究表明放疗可增强人类肿瘤移植物中TP酶的表达,从而间接增加肿瘤内氟尿嘧啶的浓度,但对周围正常组织无影响,即放疗提高了卡培他滨本身对肿瘤组织的杀伤力。

Folkman[7]首先发现了新生血管对肿瘤生长的重要作用。此后,多数人充分肯定了MVD与多种恶性肿瘤的发生、发展的密切关系。作为反映肿瘤血管生成的最有效的客观指标,目前多用二维平面上即显微镜焦平面上微血管的数量定量微血管密度。VEGF是一种具有高度生物活性的功能性糖蛋白,最早在牛垂体的腺泡细胞中发现并提取[8],是最强的一种促血管生成物质,对血管内皮细胞的增殖、基膜降解、内皮细胞迁移和血管构建的调控作用较强,且特异性高[9]。目前,抗血管生成已迅速发展为重要的抗癌策略,并成为肿瘤治疗领域的研究热点。研究显示放疗有明显的抗肿瘤血管生成作用[10]。

本课题通过动物实验对卡培他滨与放疗协同作用进行了初步探索。从实验资料中可看出,卡培他滨加放疗抑瘤作用最明显,移植瘤组织内新生血管的数量减少最明显,而且血管内皮生长因子表达率在所有处理组中均最低。二者协同抗瘤的具体机制还有待进一步研究。但由于样本量较小,有待进一步研究。

4 结语

卡培他滨联合放疗对C57BL/6J小鼠Lewis肺癌有协同抗瘤作用。

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[3]Vermeulen PB,Gasparini G,Fox SB,et al.Quantification of angiogenesis in solid human tumors:An international consensus on the methodology and criteria of evaluation[J].Eur J Cancer,1996,32A:2474～2484.

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[6]姜丽娜,于世英,熊慧华,等.胸苷磷酸化酶在癌组织中表达的研究[J].中华肿瘤杂志,2004,26(5):297～299.

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