李中南，李莉，陈光亮，汪俊

(1.安徽中医学院第一附属医院内分泌科，合肥 230031;2.安徽中医学院药理室)

随着经济的发展，人们生活水平的提高，糖尿病合并痛风发病率逐年增高，共同构成了心血管疾病的危险因素。有资料显示，重度胰岛素抵抗，胰岛B细胞分泌功能障碍，明显增加了糖代谢异常，是糖尿病合并痛风的主要代谢特征，而炎症因子、内皮细胞损伤贯穿两病的始终。过高的血尿酸可损害胰岛素B细胞诱发糖尿病已成为事实。二病并存，互为关联，互为影响，使得病情进展加速［1-2］。如何控制炎症因子，减少内皮细胞的损伤，通过多种途径，保护肾脏、血管，减少并发症是我们研究的新课题。本实验选择了安徽省中医院名老中医王正雨治疗痛风的经验方萆苓方，通过对大鼠糖尿病痛风模型的作用，观察中药对模型大鼠内皮细胞的影响，分析萆苓方降糖降尿酸的药理作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 选择健康清洁级雄性Wistar大鼠70只，四周龄，平均体质量(230±20)g。

1.1.2 药品及试剂 萆苓祛痛方，由安徽中医学院第一附属医院制剂中心提供;吲哚美辛，上海辛帕斯制药有限公司，批号:090301;二甲双胍，天津太平洋制药有限公司，批号:100604;链脲佐菌素(STZ)，美国Sigma公司，批号:s013020100109544;尿酸，美国Sigma公司，批号:058k0722;柠檬酸、柠檬酸钠(国产分析纯试剂);大鼠ET-1试剂盒，美国sigma公司生产批号:BPE10326R;大鼠NO试剂盒，南京建成生物工程研究所批号:20101027。

1.2 实验仪器 美国强生稳豪型微量血糖仪(One Touch Utra1)及配套血糖试纸;BS224S电子天平;LXJ2I型离心机(上海医用分析仪器厂);Bio—Rad 550酶标仪(美国Bio.Rad公司;Thermo Labsystems WeLLwash 4MK2全自动洗板机。

1.3 实验条件 室温20～30℃，湿度55% ～65%，空调控制。

1.4 实验方法

1.4.1 制备糖尿病大鼠模型［3-4］取大鼠70只，我院动物中心饲养，室内温度保持在25℃左右，湿度在5O%左右。明暗周期12h，自由饮水和进食。适应性喂养1周后，测体质量，大鼠体质量在230 g左右。根据体质量分层后进行随机分组:健康对照组10只，模型组10只，萆苓祛痛方大、中、小组各10只，吲哚美辛组10只，二甲双胍组10只。造模前禁食12h(不禁水)测血糖1次。

新鲜配制pH4.5的柠檬酸缓冲液(用柠檬酸和柠檬酸三钠按一定比例配制)，4～8℃ 冷藏保存。临用前将链脲佐菌素(STZ)配制成2%浓度的溶液，模型组、药物组按40 mg/kg，1 ml/100 g，单次腹腔注射此溶液1次，健康对照组折算出等量的柠檬酸缓冲液注射1次。

72 h后测大鼠空腹尾静脉血。以空腹血糖≥13.8 mmol/L作为糖尿病成模的标准。观察各组大鼠造模后进食、饮水量，大鼠精神状态、形体、毛色。造模成功后根据分组给药，连续灌胃9 d。

1.4.2 制备痛风关节炎模型［5］制备尿酸钠结晶:194 ml蒸馏水加6 ml NaOH，煮沸加1 g尿酸，用稀盐酸调pH7.2，搅拌冷却，4℃冰箱保存24 h，去上清液，用滤纸将沉淀物水分吸干，放入干燥箱70℃烘2 h，取出，刮下粉末，放人研钵内研成细末，用孔径250μm的金属网筛，过筛，装瓶备用。用时取250 mg尿酸钠结晶加45 ml0.9%氯化钠注射溶液，再加5 ml吐温80，加热搅拌配成50 g/L尿酸钠溶液。

取大鼠70只，根据上述分组称重编号，痛风模型前4 d，模型组每日灌胃等体积的0.9%氯化钠注射溶液，其他动物根据人用量与动物实验用量的换算公式，计算出每只大鼠每次给药量，萆苓祛痛方大、中、小组大鼠分别按 8 g/kg、4 g/kg、2 g/kg，吲哚美辛组大鼠按 10 g/kg，二甲双胍组大鼠按50 mg/kg，给药剂量皆为1 ml/1 g/100 g灌胃给药，每天1次，连续灌胃4 d。

第4天除正常组外，每只实验鼠均选右踝关节外侧后方为穿刺点，针口斜面朝前上方与胫骨成45°夹角穿入踝关节腔，以4号针头向关节腔注入0.2 ml尿酸钠溶液，以关节囊对侧鼓起为注入标准，诱导痛风模型。模型成功后继续灌胃5 d。末次给药后2h处死大鼠，腹主动脉抽血5 ml，加入试管，3 000 r/min离心10 min，分离血清，测定血尿酸、血糖值以及ET-1、NO并进行组间差异性比较。

1.4.3 测定大鼠血糖、血尿酸、ET-1、NO 数值，由本院生化实验室完成。

1.5 统计学处理 全部数据统计在SPSS13.0软件上进行，组间比较用t检验。

2 结果

2.1 对大鼠血糖、血尿酸的影响 模型组、药物组用药前血糖均显著高于正常组(P＜0.01)，提示糖尿病模型成功。与疗前比较，萆苓方高、中、低组、二甲双胍组均能显著降低血糖，但萆苓方作用弱于二甲双胍组。结果还显示萆苓方各组均能显著降低血尿酸，与模型组比较疗效十分显著(P＜0.01)，优于吲哚美辛组，见表1。

表1 各组大鼠血糖、血尿酸的比较()

表1 各组大鼠血糖、血尿酸的比较()

注:与模型组比较，a P ＜0.01，c P ＜0.05;与疗前组比较，b P ＜0.05

组别 鼠数(只)疗前空腹血糖(mmol/L)疗后空腹血糖(mmol/L)血尿酸(μmol/L)10 5.50 ±1.46 5.80 ±1.68 38.33 ±14.84模型组 10 16.32 ±2.42 14.91 ±3.26 68.50 ±21.36萆苓方(高)10 17.27 ±2.03 10.10 ±1.13ab 44.12 ±14.64a萆苓方(中)10 16.32 ±2.29 11.37 ±1.85ab 51.14 ±18.90a萆苓方(低)10 16.83 ±1.79 12.73 ±2.17bc 47.12 ±20.44a二甲双胍 10 17.62 ±2.52 9.28 ±2.28ab 60.11 ±8.60吲哚美辛 10 17.85 ±3.29 14.60 ±3.25 52.5 ±8.89正常组a

2.2 对大鼠ET-T、NO的影响 造模后大鼠血管内皮细胞严重受损，ET-1数值明显升高，灌胃萆苓方后(高、中剂量组)，ET-1指标下降(P＜0.05)。二甲双胍、吲哚美辛组数值仍升高。提示萆苓方对大鼠血管内皮细胞有良好的保护作用，萆苓方药物剂量与疗效具有相关性，高、中组疗效较为突出。动物造模后一氧化氮水平降低，灌胃萆苓方后，高、中、低各组的NO明显升高，与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。表明萆苓方有提高一氧化氮水平的作用，但疗效不及吲哚美辛组，见表2。

表2 各组大鼠ET-T、NO的比较()

表2 各组大鼠ET-T、NO的比较()

注:与模型组比较，a P ＜0.05，b P ＜0.01;与吲哚美辛组比较，c P ＜0.05，d P ＜0.01

组别 例数 ET-1(ng/L) NO(μmol/L)10 9.51 ±3.38 8.06 ±4.85模型组 10 11.09 ±3.67 4.71 ±2.49萆苓方(高) 10 9.14 ±2.63a 14.75 ±4.13bc萆苓方(中) 10 9.45 ±4.14a 10.05 ±3.5bd萆苓方(低) 10 12.62 ±3.07 10.12 ±2.48bd二甲双胍 10 12.54 ±3.01 13.51 ±5.84b吲哚美辛 10 13.46 ±3.82 18.16 ±5.83正常组b

3 讨论

糖尿病和痛风均为代谢性疾病，也是当今危害人们健康的常见内分泌疾病。糖尿病常伴有高血压、高血脂、肥胖、高尿酸血症等，而高尿酸血症是痛风发作的重要生化基础。肥胖、血脂紊乱、糖耐量受损、胰岛素抵抗等代谢综合征组成部分的同时出现，往往是2型糖尿病发生、发展的重要危险因素［6-7］。我们选择了痹苓方治疗糖尿病合并痛风，该方有60多年的临床实践，有一定的药理药效学实验基础［5，8］，以清热泻浊，解毒活血立法。方中土茯苓、萆解、泽泻、苡仁利湿泻浊;黄柏、苍术、虎杖清热燥湿解毒;威灵仙祛风湿、通经络、止疼痛;当归与牛膝、虎杖合用有活血定痛、利尿通淋之效。共奏泻浊解毒，活血通络之功。本次实验重点观察了萆苓方对模型大鼠内皮细胞的影响及对血糖、血尿酸的作用。

3.1 对血糖、血尿酸的影响 越来越多的研究支持2型糖尿病是一种慢性低度炎症状态的假说。有研究报道，2型糖尿病常伴有多种炎症因子浓度的升高，炎症标志物能够预测2型糖尿病的发生。有人通过实验证明了2型糖尿病患者CRP、IL-6等炎症因子水平较健康对照组明显升高，亦有实验证明抗炎治疗可明显改善2型糖尿病患者糖代谢异常。英国前瞻性糖尿病研究证实，二甲双胍可能有降低血浆CRP的水平，减少氧化应激，改善血管内皮功能的作用［9-11］。我们的实验也证实了这一点。表1提示模型动物予萆苓方后，高中剂量组的空腹血糖较前明显下降(P＜0.01)，但疗效弱于双胍组(P＜0.05)。证实萆苓方可能通过抑制炎症渗出降低动物的血糖水平。结果还提示，动物灌胃萆苓方后，高、中、低组的血尿酸水平明显下降，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。说明萆苓方降低血尿酸的疗效确切。分析其作用机制，可能是通过抑制炎症因子急时相反应，加速尿酸排泄而发挥作用的。

3.2 对内皮细胞(ET-1)的作用 ET是目前发现最强的内源性缩血管物质，具有收缩血管，促使血管平滑肌增殖的作用，其与NO是一对拮抗因子［12］。众所周知炎症引起内皮细胞结构和功能异常，可能会导致胰岛素在组织细胞中的运转障碍而促进胰岛素抵抗的发生。高尿酸血症易引起血管内皮损伤，导致或加重动脉粥样硬化。本文结果显示，动物模型组血浆ET-1水平明显高于对照组，提示糖尿病痛风可造成血管内皮细胞功能障碍。结果还报告，血尿酸水平与ET活性存在正相关性，予萆苓方后，高、中剂量组的ET-1水平下降，证实本方对血管内皮细胞有保护作用，高、中剂量组较为明显。其病理机制推测可能与下列因素相关:①尿酸盐结晶作为致炎因子可以损伤血管内皮细胞，使内皮细胞合成和释放ET-1增加，造成血浆中的ET活性增加。②研究还表明，尿酸在体外增加血小板聚集，而且尿酸盐结晶可激活血小板，使血小板活性增加，活化的血小板释放PAI-1增加，使血浆PAI-1活性进一步增高。③尿酸的产生与糖酵解有关，糖酵解由胰岛素控制，在胰岛素抵抗状态下，糖酵解过程中的中间产物向5-磷酸核糖及磷酸核糖磷酸转移，导致血尿酸生成随之增多，而高胰岛素血症本身也可引起ET释放增加，从而形成恶性循环［13］。

3.3 对一氧化氮的影响 一氧化氮 (NO)是具有舒张血管，松弛血管平滑肌和抑制内皮细胞增殖作用的物质，对糖尿病患者发病有明显影响。NO水平高低在一定程度上反映了糖尿病血管损伤的程度，NO低的糖尿病患者合并高尿酸血症的发病率及危险性都高。研究还发现一氧化氮可通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性而抑制尿酸水平。NO的基础水平取决于内皮型一氧化氮和酶基因［14］。糖尿病合并痛风，可以促进血小板活化粘附，启动血凝过程，促进血凝，并沉积于小动脉壁，损伤血管内皮细胞，降低内皮NO释放，导致血管内皮细胞功能紊乱及血管平滑肌细胞增殖，加速血管病变和糖耐量异常的发生发展［15-16］。我们在研究中注意到模型后大鼠的NO水平显著降低，予萆苓方后各组的NO明显升高，表明痹苓方有提升一氧化氮水平，保护血管内皮细胞的作用。

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