郭 震，李新锋，戴力扬

椎间盘退变的确切机理并不清楚，目前认为是在遗传易感性、衰老、力学负荷及营养供应障碍等因素共同作用下逐渐形成的［1］。随着分子生物学及分子免疫学技术的发展，细胞因子、类激素等对椎间盘退变的作用逐渐被重视起来［2-3］。2007 年，Gruber等［4］发现人体椎间盘细胞表达瘦素;本研究组也发现人体椎间盘细胞表达瘦素及其受体，瘦素对体外培养的大鼠软骨细胞有增殖作用［5］。本研究采用HE 染色对比6 月龄的ob/ob 小鼠(瘦素缺乏小鼠)和野生型小鼠(C57BL)椎间盘形态学;免疫组织化学检测两者椎间盘Ⅱ型胶原、蛋白聚糖表达;定量PCR 检测椎间盘Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原及蛋白聚糖基因表达等方面的差异，进一步探讨瘦素在活体小鼠椎间盘退变中的可能作用。

1 材料与方法

1.1 标本及其处理

雄性6 月龄野生型小鼠(C57BL 小鼠)及ob/ob小鼠(瘦素缺乏小鼠)各12 只(6 只做组织学测定，6只做分子生物学测量)，购自上海斯莱克动物中心。过量麻醉处死，分离腰椎(椎体及其椎间盘)。一部分立即放入多聚甲醛固定液中固定24 h，无菌蒸馏水冲洗后放入EDTA 中脱钙2 周，经不同梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5 μm 连续切片，以备HE 染色和免疫组化检测用。另一部分标本在显微镜下分离椎间盘后放入研钵中的Trizol 中并快速液氮冷冻、充分研磨，放置-80℃冰箱中以备RNA 提取。

1.2 方法

切片光镜观察HE 常规染色。

免疫组织化学染色 组织切片60℃烤箱过夜，然后脱蜡、不同梯度乙醇脱水、PBS 漂洗3 次后采用本研究组先前报道的方法［5］进行免疫组化染色。……