刘川鄂 吴述轩 叶 刚

（湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院，湖北 恩施 445000）

糖尿病患者围术期并发症和死亡率高于非糖尿病患者［1］，与其病理生理机制有关：糖尿病伴随的逐渐加剧的氧化应激损伤、糖尿病状态下高血糖与蛋白质形成的糖基化终末产物、增强多元醇路径导致超氧阴离子（O2-）自由基的生成、PI3K活性降低等有关［2-3］。已有研究表明，人参皂苷Rb1做为参附注射液的主要有效成分，可以减轻糖尿病心肌缺血再灌注损伤［4］，但对心肌细胞凋亡的影响及机制未明。本研究通过观察人参皂苷Rb1预处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注后心肌梗死面积、心肌细胞凋亡及心肌磷酸化Akt（p-Akt）表达的影响，探讨其减轻糖尿病大鼠心肌缺血再灌注期间心肌细胞凋亡的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性SD大鼠40只，体质量250～300 g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，许可证号：SCXK（鄂）2004-0007。

1.2 试药与仪器 药品：人参皂苷Rb1（中国药品生物制品检定所）；Wortmaninn（Sigma 公司）；细胞凋亡试剂盒（Roche 公司）；2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）（Sigma 公司）；兔抗鼠 Akt多克隆抗体（Cellsignaling Technology）。仪器：DW-2000型动物呼吸机 （上海嘉鹏科技有限公司）；Olympus BX50显微摄影系统（Olympus公司）；恒温摇床 （成都仪器厂）；-80℃深低温冰箱（SANYO 公司）；V30扫描仪（Epson公司）

1.3 模型制备 大鼠禁食12 h，腹腔注射链脲佐菌素（STZ）65 mg/kg，72 h后测定空腹血糖，连续8周空腹血糖＞16.7 mmol/L，并出现多饮、多食、多尿症状，即为1型糖尿病模型制备成功。此后每2周测定1次空腹4 h血糖和体质量，糖尿病大鼠自由饮水，普食饲养8周后制备心肌缺血/再灌注模型。大鼠腹腔注射巴比妥钠（50 mg/kg）后实行气管切开，机械通气。置皮下电极监测Ⅱ导联心电图，右侧股静脉穿刺给药。左胸第4肋间行开胸术后，切除心包膜暴露心脏，距左心耳下缘2 mm以6-0尼龙线结扎左冠动脉前降支（LAD）。LAD结扎成功标准为：左心室变白，心电图提示ST段抬高。结扎30 min后，松开结扎线以恢复血流，再灌注成功标准为：ST段回落，左心室复红。

1.4 分组及给药 大鼠随机分为模型组、联合组（人参皂苷Rb1+Wortmaninn）、人参皂苷Rb1组、Wortmaninn组，每组10只。模型组结扎LAD 30 min后恢复灌注120 min。Wortmaninn组于缺血前20 min，按15 μg/kg给予Wortmaninn；人参皂苷 Rb1组于缺血前10 min按40 mg/kg给予人参皂苷Rb1；联合组分别于缺血前20、10 min，给予相同剂量的Wortmaninn和人参皂苷Rb1。Wortmannin和人参皂苷Rb1剂量参阅文献［5-6］。

1.5 标本采集与检测 心肌梗死面积测定：再灌注结束后，再次结扎LAD，经股静脉注入2 mL 1%浓度的依文思蓝，依文思蓝使非缺血区染色，用来评估缺血区面积，快速取出大鼠心脏冷冻后使用心脏切片槽将心脏垂直于心脏长轴切为2 mm厚心肌片，置于TTC溶液室温育15 min，缺血区心肌呈砖红色，梗死区心肌呈灰白色；心肌细胞凋亡的测定：制备心肌组织石蜡切片，采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况，每一切片选择10个高倍镜视野，TUNEL阳性的细胞细胞核被染成棕褐色；心肌Akt、p-Akt的测定：免疫印迹（westernblot）对p-Akt的测定。通过凝胶成像系统扫描，确定蛋白条带密度的相对灰度值。

2 结 果

2.1 各组心肌梗死区百分比和心肌凋亡细胞百分比比较 见表1。与模型组比较，人参皂苷Rb1组心肌梗死区百分比和凋亡细胞百分比显著降低（P＜0.05）；与人参皂苷Rb1组比较，联合组心肌梗死区百分比和凋亡细胞百分比明显升高（P＜0.05）。

表1 各组大鼠心肌梗死区百分比和心肌凋亡细胞百分比比较（%，±s）

表1 各组大鼠心肌梗死区百分比和心肌凋亡细胞百分比比较（%，±s）

与模型组比较，*P＜0.05；与人参皂苷Rb1组比较，△P＜0.05。

组 别 n 梗死区 凋亡细胞模型组 10 53.37±5.45 30.70±4.96人参皂苷 Rb1组 10 42.43±6.70* 26.15±3.06*联合组 10 55.65±7.37△ 31.32±4.39△Wortmaninn 组 10 54.03±6.90 34.15±3.46

2.2 各组p-Akt表达比较 给予人参皂苷Rb1后，人参皂苷Rb1组 p-Akt表达（154.5±33.12）明显高于模型组（90.3±13.02）（P＜0.05）；而在给予Wortmannin后联合组大鼠心肌p-Akt（97.3±15.03）显著低于人参皂苷 Rb1组（154.5±33.12）（P＜0.05）。

3 讨 论

细胞凋亡是机体细胞在正常生理或病理状态下发生的一种自发的、程序化的死亡过程，它的发生受到机体的严密调控。PI3K-Akt信号通路作为细胞内重要信号转导通路之一，通过影响下游多种效应分子的活化状态，在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖的关键作用［5］。PI3K是一种可使肌醇环第3位羟基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶，具有磷脂酰肌醇激酶和丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶的双重活性。Akt是分子量约为57KU的丝/苏氨酸蛋白激酶，是PI3K/Akt信号转导通路的重要节点。近年来研究表明，PI3K-Akt能经多种途径抑制细胞凋亡，促进细胞存活。PI3KAkt信号通路抗细胞凋亡的机制主要有：（1）直接调节作用。哺乳动物细胞的细胞凋亡是多级联反应的过程。BAD是Bcl-2家族成员之一，可与Bcl-2或Bcl-xl形成复合体而表现促凋亡活性。Akt是强有力的BAD激酶，活化的Akt可以使BAD的Ser136位点磷酸化，有效阻断BAD诱导的细胞凋亡。当用特异的PI3K抑制剂Wortmaninn处理后，Akt引起的BAD磷酸化受阻［6］；（2）通过直接或间接影响转录因子家族（Forkhead、NF-κB、p53等）发挥细胞存活调控作用。磷酸化的Forkhead家族转录因子能降低FasL的表达，从而减少细胞凋亡。Vandermoere等［7］研究证明Akt能够直接或间接调节IKK的活性，导致NF-κB的核转位、活化和NF-κB依赖的促进存活基因的转录。Akt使NF-κB磷酸化后，激活它的转录功能，使促进细胞存活的Bcl-2家族成员Bcl-xl表达增强，从而促进细胞存活。（3）防止线粒体释放凋亡因子。线粒体可释放细胞色素c及凋亡诱导因子，Akt可阻止其释放从而起到抗细胞凋亡的作用［8］。

本研究中发现，糖尿病状态下给予人参皂苷Rb1治疗大鼠心肌p-Akt表达明显增加，心肌梗死面积和心肌细胞凋亡明显减少；而给予PI3K抑制剂Wortmannin后，p-Akt表达明显减少，人参皂苷Rb1促进p-Akt表达的作用明显抑制，Rb1减少梗死面积和细胞凋亡的保护作用也被消除。这表明，人参皂苷Rb1可以在糖尿病大鼠心肌通过激活PI3K促进p-Akt的表达，从而抑制心肌细胞凋亡，进而减轻糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤。此外，人参皂苷Rb1具有清除氧自由基、阻断细胞钙超载药理效应，可能是其间接抑制心肌细胞凋亡的机制。

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［4］张力，夏中元.人参皂苷Rb1预处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用的实验研究［J］.中国医药导刊，2010，12（3）：446-449.

［5］Huisamen B.Protein kinase B in the diabetic heart［J］.Mol Cell Biochem，2003，249（1-2）：31-38.

［6］Song G，Ouyang GL，Bao SD.The activation of Akt/PKB signaling pathway and cell survial［J］.J Cell Mol Med，2005，9（1）：59-71.

［7］Vandemoere F，E1 Yazidi-Beiloural Adriaenssens E，et al.The antiapoptotic effect of fibroblast growth factor-2 is mediated through muclear factor B activation induced via interaction between Akt and Kinase-βinbreastcancercells［J］.Oncogence，2005，24（35）：5482-5491.

［8］Kim EC，Yun BS，Ryoo IJ，et al.Complestatin prevents apoptotic cell death：inhibitionofamitochondrial caspasepathwaythrough AKT/PKB activation［J］.BiochemBiophysResCommun，2004，313（1）：193-204.