杨文静 邓婧 曲红梅

随着抗生素的大量应用，口腔厌氧菌的耐药性呈增加趋势［1］。因此天然物质将作为治疗口腔疾病的新方法，目前有超过25%的处方及非处方药来源于植物［2］。中草药也将为抗厌氧菌药物的研制提供广阔的前景。丹参作为祖国传统药物被广泛应用于临床。丹参的有效成分为水溶性(如:丹参素)及脂溶性(丹参酮ⅡA等［3］)两大部分。不同的提取方法获得的丹参主要成分不同［4］。丹参对金黄色葡萄球菌和其他耐药菌株有较强的抑菌作用［5，6］，但对厌氧菌的抑菌性研究较少。实验应用丹参不同的提取液对口腔厌氧菌进行抑菌实验，研究其抑菌性，为其在口腔领域中的应用提供一定的科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 (1)药物:丹参生药，由青岛大学医学院附属医院药厂提供;(2)菌株:牙龈卟啉菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)ATCC 33277，变形链球菌(Streptococcus mutans，S)，伴放线放线杆菌 (A.actinomycetemcomitans，A.a)ATCC 24523，乳酸杆菌(Lactobacillus，LB)均由首都医科大学附属北京口腔医院口腔医学研究所提供;(3)培养基MSA平板培养基，CDC平板培养基，由首都医科大学附属北京口腔医院口腔医学研究所自配。

1.2 方法

1.2.1 丹参液的制备

1.2.1.1 丹参水煎液:200 g丹参生药经水煎两次，合并滤液。留出一半液体(70 ml)，蒸发至25 ml(4000 mg生药/ml)。按倍比稀释原则，用蒸馏水将丹参水煎液制成8个浓度的制剂(最大浓度为4000 mg/ml)，高压消毒，4℃保存备用。

1.2.1.2 50%醇沉丹参液:剩余70 ml，进行50%的乙醇醇沉，(即加入70 ml 100%乙醇静置12 h后，取上清液80 ml，再加入80 ml 50%乙醇静置2 h，取上清液，并在真空负压下，温度50℃，应用旋转蒸发仪回流乙醇，)得到25 ml丹参液(4000 mg生药/ml)。稀释及消毒同上。

1.2.1.3 95%醇取丹参的提取:500 g丹参用95%乙醇3 L浸泡12 h后过滤，再加入95%乙醇3 L浸泡1.5 h过滤，并在真空负压下，温度50℃，应用旋转蒸发仪回流乙醇，得到250 ml丹参液(2000 mg生药/ml)。使其自然蒸发至膏状。用95%乙醇将95%醇取丹参浸膏溶解，配成4000 mg生药/ml的液体;按倍比稀释原则，用95%乙醇稀释成8个浓度的制剂;用过滤器(0.22 μm)过滤消毒，4℃保存备用;

1.2.2 抑菌实验:变形链球菌采用MSA平板培养基，置于厌氧罐中，微需氧环境(N290%，CO25%)，37℃温箱孵育48 h;牙龈卟啉菌、伴放线放线杆菌采用CDC平板培养基，置于厌氧罐中，厌氧环境(N280%，H210%，CO210%)，37℃ 温箱孵育120 h;乳酸杆菌采用CDC平板培养基:置于厌氧罐中，微需氧环境，37℃温箱孵育120 h。

用取菌环取菌种均匀密布于培养基上，进行培养、传代、增菌;从各平板培养基上取新鲜的细菌，用取菌环将其溶于一定量生理盐水中，使成细菌悬液，细菌达到108～109 cfu/ml;在每个新配好的各平板培养基中滴入0.1 ml菌悬液，用三角棒均匀涂布;每一平板培养基内放入3～4个钢管(钢管内径6mm，外径8mm，高10mm)，每个钢管之间留有一定的距离，在钢管内加入不同浓度的测试溶液。按上述孵育条件孵育。设95%酒精作为对照组。以上每次实验的每一药物浓度重复2次，实验重复3遍。

1.2.3 丹参液成分的测定:用HPLC法测定丹参提取液中丹参素、丹参酮的含量。

2 结果

2.1 三种丹参液对牙龈卟啉菌、伴放线放线杆菌、变形链球菌、乳酸杆菌均有抑菌性，95%乙醇对照组无抑菌性。

2.2 水煎丹参液对牙龈卟啉菌、伴放线放线杆菌、变形链球菌、乳酸杆菌的最低抑菌浓度分别为 31.25、125.00、125.00、125.00 mg/ml。其中 4000 、2000 、1000 mg/ml的水煎丹参液对牙龈卟啉菌的抑菌性差异无统计学意义(P＞0.05)，其他浓度之间抑菌性随浓度的增加而增加(P＜0.05)。对变形链球菌、伴放线放线杆菌的抑菌性随浓度的增加而增加(P＜0.05)。对乳酸杆菌的抑菌性，4000 mg/ml与1000 mg/ml差异无统计学意义(P＞0.05);2000 mg/ml的抑菌性略低，但与500、250 mg/ml之间差异无统计学意义(P ＞0.05);其他浓度之间差异有统计意义(P＜0.05)。

50%醇沉丹参液对牙龈卟啉菌、伴放线放线杆菌、变形链球菌、乳酸杆菌的最低抑菌浓度分别为 62.50、62.50、500.00、15.62 mg/ml。对牙龈卟啉菌、伴放线放线杆菌、变形链球菌、乳酸杆菌的抑菌性随浓度的增加而增加(P＜0.05)。

95%醇取丹参液对牙龈卟啉菌、伴放线放线杆菌、变形链球菌、乳酸杆菌的最低抑菌浓度分别为 15.62、15.62、62.50、15.62 mg/ml。对变形链球菌随浓度的增加而增加(P＜0.05)。对牙龈卟啉菌的抑菌性4000 mg/ml与500 mg/ml无差别(P ＞0.05);余浓度之间有差别(P ＜0.05)。对伴放线放线杆菌的抑菌性4000 mg/ml与250、125 mg/ml无差别(P＞0.05);而500 mg/ml的抑菌环最大与其他浓度有差别(P＜0.05)。对乳酸杆菌的抑菌性各浓度之间差异有统计学意义(P ＜0.05)。

2.3 通过对三种丹参液的抑菌性进行方差分析，发现95%醇取丹参对伴放线放线杆菌的抑菌性在各浓度下均优于水煎丹参和50%醇沉丹参(P＜0.05)，而水煎丹参和50%醇沉丹参的抑菌性无差别(P＞0.05);对乳酸杆菌的抑菌性有显著差别(P＜0.05)，水煎丹参低于另两种丹参液;对变形链球菌的抑菌性:浓度为 4000 、2000 、1000 、500、250 mg/ml时，95% 醇取丹参液的抑菌性优于水煎丹参液及50%醇沉丹参液(P＜0.05)，在 2000 、1000 、500 mg/ml时 50%醇沉丹参液的抑菌性优于水煎丹参液(P＜0.05);对牙龈卟啉菌的抑菌性:高浓度(2000、1000 mg/ml)时水煎丹参的抑菌性优于另两种丹参液(P ＜ 0.05)，而在低浓度(500、250 mg/ml、125 mg/ml、62.5 mg/ml、31.25 mg/ml)时95%醇取丹参的抑菌性优于另两种丹参液(P ＜0.05)。见表1～4。

表1 不同方法提取的丹参液对伴放线放线杆菌的抑菌性 n=6，mm，

表1 不同方法提取的丹参液对伴放线放线杆菌的抑菌性 n=6，mm，

药物浓度(mg/ml) 水煎丹参 50%醇沉丹参 95%醇取丹参4000 .00 14.33 ±0.61 14.17 ±0.26 14.95 ±0.232 000.00 12.97 ±0.38 12.93 ±0.10 14.03 ±0.331 000.00 11.83 ±0.26 12.12 ±0.18 12.50 ±0.45500 .00 10.92 ±0.20 11.23 ±0.26 16.50 ±0.55250 .00 10.67 ±0.52 10.57 ±0.64 15.00 ±0.32125 .00 9.50 ±0.55 10.17 ±0.26 14.33 ±0.4162 .50 8.00 ±0.00 8.25 ±0.27 13.17 ±0.4131 .25 8.00 ±0.00 8.00 ±0.00 12.28 ±0.2315 .62 8.00 ±0.00 8.00 ±0.00 11.50 ±0.55

表2 不同方法提取的丹参液对乳酸杆菌的抑菌性 n=6，mm，

表2 不同方法提取的丹参液对乳酸杆菌的抑菌性 n=6，mm，

乙醇4000 .00 13.53 ±0.49 14.13 ±0.22 15.23 ±0.52 8.药物浓度(mg/ml) 水煎丹参 50%醇沉丹参 95%醇取丹参 95%00 ±0.002 000.00 10.33 ±0.52 13.50 ±0.45 11.15 ±0.23 8.00 ±0.001 000.00 11.83 ±0.98 13.42 ±0.49 13.32 ±0.40 8.00 ±0.00500 .00 11.50 ±0.55 12.17 ±0.26 12.83 ±0.26 8.00 ±0.00250 .00 10.50 ±0.55 12.67 ±0.75 12.08 ±0.20 8.00 ±0.00125 .00 9.67 ±0.61 12.17 ±0.25 12.58 ±0.49 8.00 ±0.0062 .50 8.90 ±0.35 10.83 ±0.41 13.92 ±0.20 8.00 ±0.0031 .25 8.00 ±0.00 10.58 ±0.49 11.10 ±0.47 8.00 ±0.0015 .62 8.00 ±0.00 9.10 ±0.24 9.33 ±0.52 8.00 ±0.00

表3 不同方法提取的丹参液对变形链球菌的抑菌性 n=6，mm，

表3 不同方法提取的丹参液对变形链球菌的抑菌性 n=6，mm，

乙醇4000 .00 17.00 ±0.63 16.83 ±0.25 18.58 ±0.80 8.药物浓度(mg/ml) 水煎丹参 50%醇沉丹参 95%醇取丹参 95%00 ±0.002 000.00 14.67 ±0.61 15.50 ±0.55 16.33 ±0.52 8.00 ±0.001 000.00 10.67 ±0.61 13.33 ±0.52 14.67 ±0.52 8.00 ±0.00500 .00 10.42 ±0.49 11.33 ±0.52 12.00 ±0.32 8.00 ±0.00250 .00 9.83 ±0.26 8.58 ±0.38 10.42 ±0.49 8.00 ±0.00125 .00 9.48 ±0.41 8.00 ±0.00 9.17 ±0.26 8.00 ±0.0062 .50 8.00 ±0.00 8.00 ±0.00 8.42 ±0.38 8.00 ±0.0031 .25 8.00 ±0.00 8.00 ±0.00 8.00 ±0.00 8.00 ±0.0015 .62 8.00 ±0.00 8.00 ±0.00 8.00 ±0.00 8.00 ±0.00

表4 不同方法提取的丹参液对牙龈卟啉菌的抑菌性 n=6，mm，

表4 不同方法提取的丹参液对牙龈卟啉菌的抑菌性 n=6，mm，

乙醇4000 .00 24.50 ±0.54 25.13 ±0.21 22.00 ±0.89 8.药物浓度(mg/ml) 水煎丹参 50%醇沉丹参 95%醇取丹参 95%0000 ±0.002 000.00 25.83 ±0.52 20.30 ±0.24 14.67 ±0.82 8.00 ±0.001 000.00 24.41 ±0.66 17.00 ±0.89 13.75 ±0.76 8.00 ±0.00500 .00 14.92 ±0.66 14.43 ±0.38 21.83 ±0.75 8.00 ±0.00250 .00 13.50 ±0.45 12.58 ±0.38 18.22 ±0.45 8.00 ±0.00125 .00 11.08 ±0.66 10.10 ±0.72 13.50 ±0.45 8.00 ±0.0062 .50 9.58 ±0.66 9.43 ±0.50 13.67 ±0.61 8.00 ±0.0031 .25 8.50 ±0.55 8.00 ±0.00 11.37 ±0.53 8.00 ±0.0015 .62 8.00 ±0.00 8.00 ±0.00 8.31 ±0.40 8.00 ±0.

2.4 不同方法提取的丹参液成分。丹参素:水提取液1.38 mg/g，50%乙醇提取液0.48 mg/g，95% 乙醇提取液0.28 mg/g。丹参酮:水提取液 0.040 mg/g，50% 乙醇提取液0.637 mg/g，95%乙醇提取液 7.574 mg/g。

3 讨论

丹参具有免疫调节、改善微循环作用，对革兰氏阳性菌有明显的抑菌作用，目前已在许多临床科室用于感染性疾病的治疗，且长期应用无毒副作用出现［7，8］。不同方法提取的丹参液成分不同，实验表明，95%醇取丹参液的主要成分为丹参的脂溶性部分:丹参酮;水煎丹参液主要为水溶性成分:丹参素;50%醇沉丹参液包含两种成分，但丹参素的含量低于水煎丹参，丹参酮的含量低于95%醇取丹参液。这与以往的报道［3］相似。

实验选用的细菌中，牙龈卟啉菌，是牙周病病变区或活动部位最主要的优势菌，与牙周炎在治疗后复发或病情继续加重有关，是目前公认的牙周致病菌;伴放线放线杆菌对牙周炎特别是青少年牙周炎的发病具有重要意义，变形链球菌及乳酸杆菌与龋齿的发生发展密切相关。实验结果表明，丹参对这四种菌有一定的抑菌效果。其中95%醇取丹参的对伴放线放线杆菌、变形链球菌、乳酸杆菌的抑菌性优于另两种丹参液(P＜0.05)，说明丹参酮对该三种细菌的抑菌性强于丹参素，50%醇沉丹参对乳酸杆菌及变形链球菌的抑菌性优于水煎丹参液(P＜0.05)，也说明了这一点。而对于牙龈卟啉菌的抑菌性，在高浓度时水煎丹参也优于另两种(P＜0.05)，可能是一定浓度的丹参素对牙龈卟啉菌的抑菌性较好，这一点需要以后进一步实验证实。通过统计分析，探寻到丹参液对4种细菌的最低抑菌浓度，为以后丹参组方应用于临床提供了基础依据。

口腔的感染性疾病多为以厌氧菌为主的混合感染，由于合成抗生素耐药问题的增加，从植物中寻找天然的抗菌药物已引起人们的关注。该实验表明，丹参的水溶性及脂溶性成分对口腔的常见厌氧菌均有一定的抑菌性，可考虑将其制备成漱口液、牙周缓释膜等不同的剂型应用于牙周病、龋病等口腔疾病的预防和治疗等。

1 王淑敏.牙周厌氧菌耐药性及其控制途径.国际口腔医学杂志，2010，37:310-313.

2 Allaker RP，Douglas CW.Novel anti-microbial therapies for dental plaque-related diseases.Int J Antimicrob Agenta，2009，33:8-13.

3 国家中医药管理局《中华本草》委员会.中华本草.第1版.上海:上海科学技术出版社，1998.1653.

4 刘重芳，张钰泉，戴居云，等.丹参不同提取工艺比较.中成药，1999，21:385-388.

5 孙吉兰，常云亭，宋海英，等.丹参的体外抑菌作用研究.时珍国医国药，2003，14:725.

6 朱嘉蓉，罗厚蔚.丹参酮ⅡA的抑菌活性研究.中国药科大学学报，2004，35:368-370.

7 石乃玉，董华民，黄海金.丹参酮药理及临床应用.中国医师杂志，2001，3:150-151.

8 王定邦，刘爱生，丹参酮治疗痤疮的初步报告.中国医学科学院学报，1980，2:187-188.