杨 浩，杨青平，查成喜，韩跃武*

（1.兰州大学基础医学院;2.甘肃省第三人民医院内分泌科，甘肃兰州 730000）

引入易错PCR和DNA-shuffling技术构建单链抗体库

杨 浩1，杨青平2，查成喜1，韩跃武1*

（1.兰州大学基础医学院;2.甘肃省第三人民医院内分泌科，甘肃兰州 730000）

目的 引入易错PCR和DNA-shuffling技术构建高库容量的单链抗体库。方法 收集不同年龄、性别、健康状态的人的静脉血各5 mL，提取单个核细胞总RNA，反转录为cDNA，PCR扩增VH和VL基因，应用易错PCR对VH和VL基因进行突变，同时用DNA-shuffling技术对全长单链抗体基因进行体外改组，获得的分子与T载体连接，转化E.coliDH5α，选取阳性克隆，经菌落PCR后酶切鉴定抗体库多样性，计算分析单链抗体库容量。结果 成功构建了库容量为4.37×1013的单链抗体库，经酶切鉴定，初步判定抗体库多样性良好。结论 引入易错PCR和DNA-shuffling技术，成功构建了单链抗体库，为后续筛选高亲和力抗体奠定了实验基础。

易错PCR;DNA-shuffling;单链抗体库

*通信作者（corresponding author）:hanyuewu730000@163.com

单链抗体（single chain Fv，scFv）作为重要的基因工程抗体，是利用基因工程方法将抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过一段约5～25个氨基酸的连接肽（Linker）首尾拼接而形成的重组蛋白，具有很好的应用前景。但是，目前在构建单链抗体的过程中，往往因为抗体库的库容量不高导致筛选出的抗体的亲和力较低，影响抗体的功能［1］。本研究旨在构建高库容量的单链抗体库，为后续筛选高亲和力抗体奠定基础，也为构建高库容量核糖体展示单链抗体库提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体、菌株及细胞系:pUCm-T载体（上海生工生物工程技术服务有限公司），大肠杆菌E.coliDH5α（华美生物工程公司），基因型 SupE44△lacμ169（80lacZ △M15）hsdR17recAgyrA96thirelAl。……