李卫萍 李虹伟 顾复生

冠状动脉斑块破裂、糜烂、出血，继发冠状动脉痉挛和血栓形成是急性冠状动脉综合征(acute coronary syndromes，ACS)发生发展的关键环节。随着研究的不断深入，人们发现炎症在不稳定斑块的发生、进展及破裂过程中发挥着重要作用。目前认为炎症反应是动脉粥样硬化的应答性反应，在冠状动脉损伤的早期起保护作用，但当损伤持续存在时应答性反应则可能演变为过度的炎症，并促成斑块的形成和破裂。近年的研究表明，妊娠相关血浆蛋白 A(pregnancy associated plasma protein-A，PAPPA)是预测不稳定斑块的新的标志物，与炎症密切相关，可用于ACS的早期诊断和风险评估［1-3］。我们的前期研究提示，炎症因子C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)可在转录水平上呈剂量依赖性诱导人外周血单核细胞(PBMCs)的PAPP-A基因表达，但具体细胞内信号调控途径尚不清楚［4］。核转录因子(nuclear factor-κB，NF-κB)是一种调节基因转录的关键因子，对多个炎症反应相关基因的表达具有调控作用，从而参与细胞黏附、炎细胞趋化和细胞外基质降解等病理过程。本研究旨在进一步探讨NF-κB是否参与CRP对人PBMCs的PAPP-A基因和蛋白表达的调控。

1 材料与方法

1.1 材料

CRP(美国Sigma公司);RPMI1640培养基、胎牛血清、M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs、Oligo(dT)15、琼脂糖(美国Promega公司);Trizol(美国Invitrogen公司)，SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(美国ABI公司);DNA Marker(北京天为时代科技有限公司)，PCR引物(北京赛百盛公司);淋巴细胞分离液(中科院血液病研究所)，兔抗人PAPPA抗体(美国 Abcam公司)，膜蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、兔抗β-actin抗体、羊抗兔二抗(北京尚柏生物医学技术有限公司);核蛋白提取试剂盒、NF-κB p65检测试剂盒(美国 Active Motif公司)。

1.2 细胞分离培养及实验分组

清晨空腹采集健康志愿者外周肘静脉血20 ml，采用密度梯度离心法分离PBMCs。台盼蓝染色实验显示活细胞率＞95%。将细胞悬于RPMI 1640培养基中，接种于培养皿中。细胞实验分组:(1)按作用时间不同分组:CRP(20 mg/L)作用于PBMCs不同时间(2、8、16和24 h);(2)按作用浓度不同分组:CRP(5、10和20 mg/L)作用于PBMCs 24 h;(3)BAY11-7082干预组:预先用 BAY11-7082(20 μmol/L)与PBMCs共同孵育60 min后，再加入20 mg/L CRP作用24 h。

1.3 PAPP-A蛋白表达水平的测定

取细胞裂解液，用Lowry法测定蛋白浓度，进行100 g/L SDS-PAGE(各孔加样量为50 μg)并电转移至PVDF膜上。将膜置于封闭液4℃过夜。洗膜后分别滴加兔抗人PAPP-A抗体和兔抗人β-actin抗体，室温摇床上温育2 h，TBST漂洗3次，然后滴加HRP-山羊抗兔IgG，室温温育1 h，TBST漂洗3次。在避光条件下，将膜置于显色液中，待显色至条带清晰时，将膜放入蒸馏水中漂洗，终止反应。显色膜经拍照保存为电子照片，经IPP 6.0图像分析软件测定图片上各条带的灰度值。目的蛋白的灰度值除以内参β-actin灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。

1.4 PAPP-A mRNA表达水平的测定

采用实时荧光定量PCR法测定。收集各组细胞，用Trizol试剂提取总RNA，测定RNA纯度、浓度后，进行反转录，按试剂盒说明书进行。阴性对照不含M-MLV反转录酶或RNA模板。所得cDNA在荧光定量实时PCR仪上进行反应。PAPP-A及β-actin基因序列通过GenBank获得，采用Primer 5.0软件设计。PAPP-A上游引物 5'-GAG GAG TTG GCA GGA GTA GCA-3'，下游引物5'-GCC CAG GCT GGC TGT GAC CAA T-3'，长度为 141 bp。β-actin 上游引物 5'-TGA AGA TCA AGA TCA TTG CTC C-3'，下游引物5'-GGG TGT AAC GCA ACT AAG TCA TA-3'，扩增产物长度184 bp。PCR反应参数:50℃2 min，95℃10 min，95℃变性15 s，60℃退火和延伸 1 min，共50个循环。在延伸的过程中搜集荧光信号，于每次扩增的同时设置无cDNA的阴性对照，将PCR产物做熔解曲线，以证实PCR产物的特异性。用7300 System SDS Software分析数据，以β-actin为内参，根据所得样本Ct值计算标准的2－ΔΔCt值.表示mRNA的相对表达量。

1.5 NF-κB 活性测定

采用Active Motif的专利技术TransAMTM定量检测磷酸化 NF-κB p65 水平代表 NF-κB 激活程度［5］。提取单核细胞的核蛋白后，应用Bradford法测定蛋白浓度。在待测样品孔每孔加入20 μl核蛋白提取液，将反应板置于自动旋转振荡仪上以100 r/min的速度轻轻摇动，室温下反应1 h后用缓冲液洗涤3次。加酶标一抗反应1 h，洗涤3次，再加酶标二抗反应1 h，洗涤4次。加底物显色，终止后用酶标仪以主波长450 nm，次波长655 nm比色，根据重组蛋白标准曲线及样品反应吸光度值计算NF-κB p65的含量。

1.6 统计学方法

以上实验均重复6次。应用SPSS 13.0统计软件进行分析，实验所得数据进行正态性检验，用均数±标准差(±s)表示。组间比较采用t检验及方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRP诱导人PBMCs的PAPP-A蛋白和mRNA表达的时间效应

给予CRP(20 mg/L)刺激 PBMCs后，PAPP-A的蛋白和mRNA表达在2 h开始升高，随刺激时间延长而持续升高(P＜0.05)，即呈时间依赖性，见表1、图1。

表1 CRP作用PBMCs不同时间对PAPP-A蛋白和mRNA表达的影响(±s)

表1 CRP作用PBMCs不同时间对PAPP-A蛋白和mRNA表达的影响(±s)

注:与空白对照组比较，aP＜0.05

作用时间(h) 例数 PAPP-A的蛋白表达 PAPP-A的mRNA 表达0(空白对照)6 0.0989±0.0065 1.000 2 6 0.1932±0.0110a 1.431±0.113a 8 6 0.2561±0.0131a 1.790±0.183a 16 6 0.2691±0.0121a 2.451±0.307a 24 6 0.2999±0.0182a 3.580±0.395a

图1 CRP作用PBMCs不同时间对PAPP-A蛋白表达的Western blot结果

2.2 CRP诱导人PBMCs的PAPP-A蛋白和mRNA表达的剂量效应

给予不同浓度CRP(5、10和20 mg/L)刺激24 h后，人 PBMCs的PAPP-A蛋白和mRNA表达随CRP浓度的增加而升高(P＜0.05)，即呈剂量依赖性，见表2、图2。

表2 不同浓度CRP对PBMCs的PAPP-A蛋白和mRNA表达的影响(±s)

表2 不同浓度CRP对PBMCs的PAPP-A蛋白和mRNA表达的影响(±s)

注:与空白对照组比较，aP＜0.01

CRP(mg/L) 例数 PAPP-A的蛋白表达 PAPP-A的mRNA 表达0(空白对照)6 0.1001±0.0116 1.000 5 6 0.1573±0.0721a 1.736±0.212a 10 6 0.2591±0.0650a 2.590±0.313a 20 6 0.3507±0.0903a 3.684±0.416a

图2 不同浓度CRP对PBMCs的PAPP-A蛋白表达的Western blot结果

2.3 CRP对人PBMCs的NF-κB活性影响

与对照组［(0.35±0.04)mg/L］比较，CRP组磷酸化 NF-κB p65水平升高［(0.88±0.06)mg/L，P＜0.05］，BAY11-7082 组 NF-κB p65 水平下降［(0.21±0.03)mg/L，P ＜0.05］，而 CRP+BAY11-7082组磷酸化NF-κB p65水平［(0.38±0.06)mg/L］较CRP组降低(P＜0.05)，与空白对照组相比差异无统计学意义。

2.4 CRP通过NF-κB途径上调人PBMCs的PAPPA表达

给予 BAY11-7082预处理60 min，再加入CRP(20 mg/L)作用 24 h后，人 PBMCs的PAPP-A蛋白和mRNA表达较CRP刺激组显著下降，与空白对照组相比差异无统计学意义，见表 3、图 3。

表3 不同浓度CRP对PBMCs的PAPP-A蛋白和mRNA表达的影响(±s)

表3 不同浓度CRP对PBMCs的PAPP-A蛋白和mRNA表达的影响(±s)

注:与空白对照组比较，aP＜0.01;与CRP+BAY11-7082组比较，bP＜0.01

组别 例数 PAPP-A的蛋白表达PAPP-A的mRNA空白对照组6 0.0861±0.0116 1.000 BAY11-7082组 6 0.0905±0.0154 0.920±0.120 CRP组 6 0.3415±0.0903ab 3.684±0.416ab CRP+BAY11-7082组6 0.0921±0.0241 1.150±0.106

图3 NF-κB抑制剂对PBMCs的PAPP-A蛋白表达的Western blot结果

3 讨论

越来越多的证据表明，冠状动脉斑块的进展与炎症反应的程度密切相关。斑块内的炎症反应产生和释放细胞因子，能够趋化、活化中性粒细胞和单核细胞，促进血管内皮细胞表达黏附分子和其他炎症介质，破坏斑块表面纤维组织的完整性，同时减少细胞外基质的合成，从而促进斑块的破裂。

PAPP-A是基质金属蛋白酶超家族的新成员，近年研究表明PAPP-A是预测斑块不稳定、冠状动脉病变程度及预后的新标志物，并不受调脂治疗的影响。PAPP-A参与ACS的可能机制包括:(1)激活内源性的抗凝血酶3而抑制凝血酶介导的凝血过程，同时抑制纤维蛋白原的分解，促进凝血过程;(2)降解粥样斑块内的细胞外基质，促进纤维帽内胶原纤维和弹力纤维降解，破坏纤维帽结构，导致斑块破裂，脂核暴露，引起血小板黏附、聚集，继发血栓形成;(3)PAPP-A可裂解IGFBP-4，增加游离IGF-I的释放和活性，促使平滑肌细胞增殖、炎症细胞因子和趋化因子释放、泡沫细胞增加和新生血管生成。已有的研究表明，肿瘤坏死因子(TNF)或白介素-1β可诱导人成纤维细胞、成骨细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞PAPP-A的表达［6-7］，而对于单核细胞的PAPP-A表达的调控机制研究很少。单核细胞是动脉粥样斑块形成过程中最重要的炎症细胞［8］。本研究显示，CRP可呈时间、剂量依赖性诱导人PBMCs的PAPP-A蛋白和mRNA基因表达，证实了PAPP-A与炎症的相关性。我们既往的研究发现，ACS患者PBMCs的PAPP-A mRNA表达显著增高，与外周血循环中的血清PAPP-A水平变化相似，提示PAPP-A主要是由活化的单核细胞合成并分泌到血循环中。为了进一步阐明其中的细胞信号调控途径，我们观察 CRP是否通过 NF-κB途径影响PBMCs的PAPP-A表达。

NF-κB作为一种转录因子参与调节多种炎症蛋白基因的表达。在生理状态下，NF-κB与其抑制蛋白IκB非共价结合以无活性的三聚体形式存在于胞浆中。当细胞受到缺血缺氧等刺激后，IκB被降解，NF-κB迅速活化进入胞核孔体内，与炎性因子基因启动子区域中的κB位点结合，发挥调控基因转录的作用，参与炎症、免疫反应、细胞凋亡等病理生理过程，促进ACS 发生发展［8-9］。Ritchie［10］采用电泳迁移率方法发现，不稳定心绞痛患者的单核细胞NF-κB活性增加，且与冠状动脉病变的严重程度相关。一些实验研究表明，CRP可以诱导脐静脉内皮细胞和人主动脉内皮细胞 NF-κB活性的增加［8］。本研究显示，CRP可显著上调人PBMCs的磷酸化NF-κB p65水平，提示NF-κB活性增加。在给予NF-κB抑制剂BAY11-7082预处理阻断NF-κB途径后，再予以CRP刺激，结果显示随着单核细胞磷酸化NF-κB p65水平的下降，PAPP-A蛋白及基因表达都较单用CRP刺激组显著下降，与对照组差异无统计学意义。

综上所述，本实验提示CRP可以通过激活NF-κB途径，诱导人PBMCs的PAPP-A蛋白和基因表达，在一定程度内呈浓度-时间效应，进一步阐明了ACS患者血清PAPP-A水平及其PBMCs的PAPP-A mRNA表达增加的机制，这也将为如何减少炎症，防治急性心血管事件提供新的理论依据和治疗靶点。

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