唐晓勇，唐迎雪

(1山东中医药大学，济南250355;2山东省肿瘤医院)

目前，干预和克服多药耐药是提高肺癌疗效的重要手段。浙贝母碱是中药浙贝母的主要成分，近年来其抗肿瘤作用逐渐得到广泛认同。人肺耐药蛋白(LRP)被认为与顺铂(DDP)原发耐药关系密切。2010年3月～2011年6月，我们观察了浙贝母碱对人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP多药耐药的逆转作用，并进一步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP购自上海拜力生物科技有限公司。浙贝母碱(贝母素甲)，顺铂，RPMI-1640培养基和12%小牛血清，MTT，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，鼠抗人LRP单克隆抗体。EL340i酶标仪，FACS Calibur流式细胞仪，LSM510型激光共聚焦显微镜。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 A549/DDP细胞用12%胎牛血清培养，用2μg/mL的DDP维持其耐药性;在37℃、5%CO2的培养箱中培养，2 d传代1次。实验前2周将A549/DDP细胞换用无DDP的培养基培养，选取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 浙贝母碱对A549/DDP细胞增殖的影响及其逆转耐药最佳浓度的确定 采用MTT法。将处于对数生长期的A549/DDP，用胰蛋白酶、EDTA消化后计数;用含12%胎牛血清在RPMI-1640培养基配成一定浓度，以5×103/孔接种96孔板;细胞贴壁后，实验组加入终质量浓度分别为50、100、200、400、800μg/mL的浙贝母碱，置37 ℃、5%CO2的培养箱中培养;对照组加相同浓度的药物溶解介质，每个浓度设3个平行孔。培养48 h后，每孔分别加入20μL的MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h。然后以1 000 r/min离心3 min，弃上清;每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。全自动酶标仪于570 nm处测定各孔吸光值(A值)，参比波长为630 nm。实验重复3次，取平均值。细胞增殖抑制率=(1－实验组A值/对照组A值)×100%。根据文献，确定细胞增殖抑制率≤5%的药物浓度为该药的非细胞毒性浓度，并作为最佳逆转耐药浓度。

1.2.3 浙贝母碱对A549/DDP细胞耐药逆转作用的观察 采用 MTT法。将处于对数生长期的A549/DDP，消化、接种同 1.2.2。对照组分别加入终质量浓度为 0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μg/mL的DDP，实验组在对照组基础上再加入逆转浓度的浙贝母碱。全自动酶标仪于570 nm处测定各孔A值，参比波长为630 nm。实验重复3次，取平均值。细胞增殖抑制率=(1－实验组A值/对照组A值)×100%。采用直线回归方程计算出细胞生长抑制率50%时的DDP浓度，即为半数抑制浓度(IC50)。逆转倍数=对照组IC50/实验组IC50。

1.2.4 浙贝母碱对A549/DDP细胞凋亡影响的观察 采用流式细胞术。取处于对数生长期的A549/DDP，分为3组。空白对照组不加任何药物，对照组加入DDP(终质量浓度为4μg/mL)，实验组在对照组基础上再加入逆转浓度的浙贝母碱。药物作用48 h后，吹打成细胞悬液;以2 000 r/min离心5 min，收集细胞;用PBS洗涤细胞2次，收集2×105个细胞，加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞;加入5μL Annexin V-FITC混匀后，再加入20μL Propidium Iodide混匀;室温避光，反应5～15 min;加入250μL Binding Buffer到样品中，混匀后300目尼龙网过滤;在1 h内进行流式细胞仪的上机观察和检测分析，激发波长(Ex)为488 nm，发射波长(Em)为530 nm。

1.2.5 浙贝母碱对A549/DDP细胞中LRP蛋白表达影响的观察 采用细胞免疫荧光法。取对数生长期的细胞，分组及处理同1.2.4。培养48 h后取出盖玻片，以PBS液漂洗3次;按试剂盒说明操作，荧光显微镜下观察。LRP蛋白阳性表达细胞呈现绿色荧光。高倍镜下(×200)随机观察5个视野，计算阳性细胞个数，取平均值，表示LRP蛋白表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件。组间数据比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 浙贝母碱对A549/DDP细胞增殖的影响及其逆转耐药的最佳浓度 50、100、200、400、800 μg/mL的浙贝母碱作用48 h，A549/DDP细胞增殖抑制率分别为 2.31% ± 0.25%、2.58% ± 0.17%、3.62% ±1.12%、4.54% ±0.86%、9.33% ±0.22%，浙贝母碱逆转耐药的最佳浓度为400μg/mL。

2.2 浙贝母碱对A549/DDP细胞耐药的逆转作用各组随DDP浓度的增加，浙贝母碱对A549/DDP细胞增殖抑制率不断增加(P均＜0.05)。实验组DDP 的 IC50为4.15 μg/mL，对照组为15.46 μg/mL，浙贝母碱的逆转耐药倍数为3.73。见表1。

表1 浙贝母碱对A549/DDP细胞耐药的逆转作用

2.3 浙贝母碱对A549/DDP细胞凋亡的影响 培养48 h后，空白对照组的细胞凋亡率为2.56% ±0.44%，对照组为 13.5% ± 1.42%，实验组为38.16% ±2.25%;实验组细胞凋亡率与对照组、空白对照组比较，P均＜0.05。

2.4 浙贝母碱对A549/DDP细胞LRP蛋白表达的影响 培养48 h后，空白对照组LRP蛋白阳性表达细胞为(9.8 ±1.92)个/HP，对照组为(9.2 ±1.9)个/HP，实验组为(5.8 ±1.3)个/HP;实验组 LRP 蛋白阳性表达细胞数与对照组、空白对照组比较，P均＜0.05。

3 讨论

肿瘤多药耐药的可能机制包括细胞内的药物浓度降低、药物解毒系统活性增强［1］、DNA修复机制增强［2，3］、药物诱导凋亡的变更［4，5］等。其中 LRP 介导的药物外排机制是DDP耐药的重要原因。LRP与P-gp、MRP不同，不属于ABC超家族成员，也没有与ATP结合的跨膜转运区域。LRP主要分布于细胞质而非细胞膜，是构成人体穹窿蛋白的主要成分，广泛分布在人体与外界相通的体腔上皮、血脑屏障、巨噬细胞和分泌性器官中，被认为与机体清除有害物质有关。研究［6］证实，LRP与铂类药物的原发性耐药关系密切。LRP诱导肺癌细胞多药DDP耐药的机理包括:①阻止DDP进入细胞核，或者将己进入核内的药物通过转运载体泵至核外;②将胞质中的DDP转运至囊泡，使药物呈房室性分布，通过胞吐机制将药物排至细胞外。

耐药逆转剂的研究，现代医学主要从应用分子生物学技术(如小干扰RNA沉默耐药相关基因［7］)和化学合成药物(如托瑞米芬［8］、环孢菌素［9］、维拉帕米［10］等)方面展开，多因技术繁琐或不良反应大而未广泛应用于临床。浙贝母是临床上常用化痰药物，其药理作用包括镇咳化痰、松弛支气管平滑肌［11］，镇痛、抗炎［12］，降压、活血化瘀，抗溃疡及逆转细菌耐药［13］等作用。作为浙贝母的主要成分，浙贝母碱的抗肿瘤作用越来越得到广泛认同，尤其是在逆转肿瘤耐药方面具有广泛的研究前景，有望成为有效的多药耐药逆转剂。胡凯文等［14］应用浙贝母碱逆转白血病细胞的多药耐药现象，MTT显示浙贝母碱对阿霉素杀伤多药耐药K562/A02、HL-60/Adr细胞株具有明显的增敏作用，逆转倍数约为5。流式细胞仪显示，浙贝母碱通过抑制耐药细胞P-gp蛋白表达，从而增加了DNR在耐药白血病细胞内的蓄积，逆转了部分细胞的耐药性。本研究结果显示，浙贝母碱逆转耐药倍数3.73。与空白对照组、对照组比较，实验组细胞凋亡率增高，表达量明显降低(P＜0.05)。因此，浙贝母碱可逆转肺癌A549/DDP细胞株的多药耐药，其机理与促进细胞凋亡、下调L-RP蛋白表达介导药物重新分布有关。

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