李能章，邱荣蓉，黄园媛，邹灵秀，彭远义*

(1.西南大学动物科技学院，重庆 400716；2.重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054)

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，主要侵染猪肺部和淋巴组织中的巨噬细胞和树突状细胞[1]。病毒在细胞中大量复制组装，破坏宿主细胞原有细胞结构，导致这些细胞功能丧失从而使整个机体免疫功能下降[2-3]。不同病毒对细胞结构破坏程度差异决定了感染细胞最终命运。现有研究认为，囊膜病毒的囊膜来源于宿主细胞的各种膜，但不同病毒形成最终病毒粒子时获取囊膜的位置存在差异。PRRSV囊膜来源于宿主细胞内膜成分，但具体来源于细胞哪部分膜，目前并不清楚。因此，研究病毒获取囊膜的位置，对了解该病毒在宿主细胞中装配的时空区域有着重要意义。本研究选择PRRSV囊膜蛋白GP5作为一种指示蛋白，通过其在酿酒酵母中的表达定位来间接反映PRRSV在感染细胞中获取囊膜的可能位置。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 含PRRSVgp5基因的pMD-gp5重组质粒、E.coliDH5a菌株、酿酒酵母菌株CEN.PK2及定位表达载体pUG35(带有gfp基因)均由本实验室保存；pMD19-T Simple载体、BamHⅠ、SalⅠ、ExTaqDNA聚合酶、DNA Ligation Kit ver 2.1购自TaKaRa公司；无氨基酸酵母氮源YNB购自生工生物工程(上海)有限公司；Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil(Y1501)和多种氨基酸购自Sigma公司。

1.2 gp5基因重组表达质粒的构建 将gp5基因克隆到酿酒酵母表达载体pUG35中gfp基因上游位置，构建gp5-gfp融合基因重组表达质粒pUG-gp5-gfp，重组质粒经双酶切及测序验证其正确性。

1.3 基因重组酿酒酵母筛选[4-5]将测序验证正确的pUG-gp5-gfp采用ApaⅠ线性化处理，纯化回收后，电击导入酿酒酵母CEN.pk2细胞中，涂布于尿嘧啶营养缺陷培养基进行阳性重组酵母筛选，PCR方法进行确证。……