郝凤奇，李景梅*，杨桂连

(1.长春理工大学生命科学技术学院，吉林 长春 130022；2.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118)

乳酸菌作为人和动物消化道内的正常菌群，被公认为“安全级”的微生物[1]。构建乳酸菌质粒表达载体对于制备功能性重组乳酸菌至关重要。Nisin为由某些乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)分泌的一种小分子抗生物肽，由34个氨基酸组成，分子量约为3.5 ku，能够抑制多数食品腐败菌的生长，对人和动物无害，是一种高效、无毒的天然食品防腐剂[2]。Nisin生物合成的基因簇包括：nisABTCIPRKFEG，nisR与nisK构成双组分调控元件。Nisin的合成遵循密度感受原理，首先，nisR的组成型启动子持续启动nisK表达组氨酸激酶(NisK)，同时nisR自身编码应答调节蛋白(NisR)；其次，NisK为膜结合感应蛋白，其N末端位于细胞外，可在少量Nisin存在时，发生自身磷酸化，并将磷酸基团传递给细胞内的NisR；最后，磷酸化被激活的NisR可作为转录激活物启动下游诱导型启动子nisA/nisF的基因表达。

本研究将Nisin生物合成的双组份调控元件nis-RK基因亚克隆至pW425et中，并以诱导型启动子nisA基因替换基础质粒中的组成型启动子P32，构建乳酸菌Nisin诱导表达质粒载体pW425N，以gfp作为报告基因，检测载体的诱导表达功能。研究结果为功能性重组乳酸菌的制备和应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 质粒与菌种 分泌型基础质粒pW425et、含有gfp基因的质粒pGEM-T-gfp由吉林农业大学王春凤教授惠赠；pGEM-T-nisRK由本研究室构建[3]；猪源嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)分离自仔猪肠道，产NisinL.lactis分离自牛乳，均由吉林农业大学动物微生态学研究室保存；pMD18-T购自TaKaRa公司；E.coliDH5α感受态细胞购自TaKaRa公司。……