贾 楠，刘月平，李 勇*

（1.河北医科大学第四医院外三科，河北石家庄 050011；2.河北医科大学第四医院病理科，河北石家庄 050011）

·论 著·

胃癌组织Pokem on和p14ARF表达率及其在临床生物学行为中的意义

贾 楠1，刘月平2，李 勇1*

（1.河北医科大学第四医院外三科，河北石家庄 050011；2.河北医科大学第四医院病理科，河北石家庄 050011）

目的探讨胃癌组织中Pokemon、p14ARF蛋白表达率及其与临床生物学行为的关系。方法取手术切除胃癌组织标本50例，正常胃黏膜组织标本20例，用免疫组织化学方法检测胃癌组织、正常胃黏膜组织Pokemon和p14ARF蛋白的表达，并且分析二者表达情况与胃癌患者性别、年龄、肿瘤部位、瘤体大小、大体分型、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、临床分期等临床生物学特征的关系。结果①在胃癌组织和正常胃黏膜组织中Pokemon和p14ARF均表达于细胞核，在阳性染色的细胞核中呈现棕黄色颗粒。Pokemon蛋白表达率在胃癌组织中为78%，在正常胃黏膜组织中为45%，二者差异有统计学意义（P＜0.05）。p14ARF蛋白表达率在胃癌组织中为42%，在正常胃黏膜组织为90%，二者差异有统计学意义（P＜0.05）。②胃癌组织中Pokemon蛋白表达率在有淋巴结转移组为87.5%，在无淋巴结转移组为40%，二者差异有统计学意义（P＜0.05）。随着肿瘤增大、浸润程度加深及临床分期升高，胃癌组织中Pokemon蛋白表达有升高趋势。③胃癌组织中p14ARF蛋白表达率在有淋巴结转移组为37.5%，在无淋巴结转移组为80%，二者差异有统计学意义（P＜0.05）。随着肿瘤分化程度的降低、浸润程度的加深及临床分期的升高，胃癌组织中p14ARF蛋白表达有降低的趋势。④胃癌组织中，Pokemon与p14ARF蛋白表达呈现负相关（r=-0.280，P=0.049）。结论胃癌组织Pokemon高表达和p14ARF低表达可反映胃癌的发生发展、侵袭及转移等临床生物学行为的程度。

胃肿瘤；Pokemon蛋白；肿瘤抑制蛋白质；p14ARF

胃癌是人类最常见的消化系统恶性肿瘤。胃癌的发生与转归是一个机制复杂的过程，其中分子生物学机制主要有癌基因激活和抑癌基因失活。Pokemon基因（POK erythroid ontogenic factor）为原癌基因，在细胞分化过程中具有多效性功能。该基因通过抑制某些抑癌基因，致细胞内抑制机制缺陷和细胞增殖失控，进而发生肿瘤［1］。可变阅读框（alternative reading frame，ARF）基因通过编码p14ARF肿瘤抑制蛋白参与细胞周期调控和p53途径，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤形成［2］。本研究采用免疫组织化学法（streptavidin peroxidase，SP）检测胃癌组织及正常胃黏膜组织中Pokemon和p14ARF蛋白的表达及其在临床生物学行为中的作用，以探讨Pokemon和p14ARF在胃癌发生与转归中的意义，为胃癌临床分子生物学分期、预后及指导综合治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：收集河北医科大学第四医院外三科2006年10月—2009年8月接受手术切除治疗的胃癌组织标本50例，其中男性38例，女性12例；＜50岁者12例，≥50岁者38例，年龄37～75岁，中位年龄56岁。肿瘤位于贲门与胃底部7例，胃体部20例，胃窦部23例；直径＜5.0cm者25例，≥5.0cm者25例；局限型（BorrmannⅠ、Ⅱ）24例，浸润型（BorrmannⅢ、Ⅳ）26例；高和中分化腺癌21例，低分化腺癌29例；浸润深度为T1+T2 9例，T3+T4 41例；有淋巴结转移者40例，无淋巴结转移者10例；临床分期为Ⅰ+Ⅱ期9例，Ⅲ+Ⅳ期41例。另取正常胃黏膜组织标本20例（距癌灶边缘＞5.0cm，经病理学证实无肿瘤细胞）作为对照组。所有患者术前均未经放疗和化疗，其临床记录均按照“全国胃癌诊治规范”［3］进行登记。

1.2 试剂与方法：取手术切除的胃癌组织、正常胃黏膜组织标本放入10%甲醛固定24h，常规石蜡包埋，4μm连续切片。用免疫组织化学SP法测定胃癌组织标本中Pokemon和p14ARF。按试剂盒说明进行（北京中杉生物技术有限公司）。Pokemon一抗为兔抗人多克隆抗体（美国ProMab公司），p14ARF鼠抗人单克隆抗体（美国Cell Signaling公司），均购自河北海森生物技术开发有限公司。抗体的稀释度为1∶200。以PBS代替第一抗体的胃癌组织免疫组织化学染色结果作阴性对照；试剂盒自带阳性片免疫组织化学染色结果作为阳性对照。

1.3 实验结果判断：免疫组织化学结果判定标准，光镜下，Pokemon蛋白和p14ARF蛋白表达主要定位于细胞核，以胞核中出现明显棕黄色颗粒为阳性细胞。参考Fromowitz阳性细胞半定量分级法，观察整张切片，根据阳性细胞所占的百分数计分，≤5%计0分，＞5%～25%计1分，＞25%～50%计2分，＞50%～75%计3分，＞75%计4分；再根据阳性细胞染色强度计分，无着色计0分，淡黄计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；两者积分相加所得的总分，按照0～1分为（-），2～3分为（+），4～5分为（++），6～7分为（+++）。以（-）和（+）定为低表达，（++）和（+++）定为高表达。

1.4 统计学方法：应用SPSS12.0统计软件包进行数据处理，计数资料以百分率表示，采用χ2检验，相关性采用Spearman等级相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胃癌组织及正常胃黏膜组织中Pokemon蛋白的表达：在胃癌组织和正常胃黏膜组织中Pokemon主要表达于细胞核，阳性染色的细胞核中呈现出棕黄色细颗粒（图1）。胃癌组织中Pokemon蛋白表达39例（78%），正常胃黏膜组织中表达率（45%），二者差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 Pokemon和p14ARF在胃癌组织与正常胃黏膜组织中的表达Table 1 Expression of Pokemon and p14ARFin gastric carcinoma tissues and normal gastricmucosa

2.2 胃癌组织Pokemon蛋白表达及其在临床生物学行为中的意义：有淋巴结转移组的胃癌组织中Pokemon蛋白表达率为87.5%，无淋巴结转移组为40.0%，二者差异有统计学意义（P＜0.05）；胃癌组织Pokemon蛋白表达在患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、大体分型、分化程度、浸润深度、临床分期等因素间均差异无统计学意义（P＞0.05）。但是，Pokemon蛋白表达率随着肿瘤的增大（直径≥5.0cm组较直径＜5.0cm组）、浸润程度的加深（T3+T4组较T1+T2组）和临床分期的升高（Ⅲ+Ⅳ期组较Ⅰ+Ⅱ期组）有升高趋势，见表2。

2.3 胃癌组织及正常胃黏膜组织中p14ARF蛋白的表达：胃癌组织和正常胃黏膜组织中p14ARF蛋白主要表达于细胞核，阳性细胞染色呈核内棕黄色细颗粒状（图2）。胃癌组织中p14ARF蛋白表达率42%，正常胃黏膜组织90%，二者差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表2 胃癌组织中Pokemon表达与临床组织病理特征的关系Table 2 Correlation between the expression of Pokem on in gastric carcinoma tissues and clinical histopathologic characteristics

Body of stomach 20 18（90.0）2（10.0）1.828 0.176 Sinus ventriculi 23 17（739）6（26.1）0.719 0.397 Tumor diameter（L/cm）＜5 25 18（72.0）7（28.0）≥5 25 21（84.0）4（16.0）1.049 0.496 Typing Localized type 24 19（79.2）5（20.8）Infiltrating type 26 20（76.9）6（23.1）0.037 0.848 Differentiation High and Moderate 21 17（80.9）4（19.1）Low 29 22（79.3）7（20.7）0.007 0.741 Depth of invasion T1+T2 9 5（55.6）4（44.4）T3+T4 41 34（70.7）7（29.3）0.239 0.628 Lymph nodemetastasis Yes 40 35（87.5）5（12.5）No 10 4（40.0）6（60.0）7.933 0.004 Tumor stageⅠ～Ⅱ9 6（66.7）3（33.3）Ⅲ～Ⅳ41 33（80.5）8（19.5）0.214 0.392

2.4 胃癌组织p14ARF蛋白表达及其临床生物学行为的意义：有淋巴结转移组的胃癌组织中p14ARF蛋白表达率为37.5%，无淋巴结转移组为80.0%，二者差异有统计学意义（P＜0.05）。胃癌组织中p14ARF蛋白表达在患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、大体分型、分化程度、浸润深度、临床分期等因素间均差异无统计学意义（P＞0.05）。但是，p14ARF蛋白表达率随着分化程度的降低（低分化组较高和中分化组）、浸润程度的加深（T3+T4组较T1+T2组）和临床分期的升高（Ⅲ+Ⅳ期组较Ⅰ+Ⅱ期组）有降低趋势，见表3。

表3 胃癌组织中p14ARF表达与临床组织病理特征的关系Table 3 Correlation between the expression of p14ARFin gastric carcinoma tissues and clinical histopathologic characteristics

Typing Localized type 24 10（41.7）14（58.3）Infiltrating type 26 11（42.3）15（57.7）0.002 0.963 Differentiation High andmoderate 21 9（42.9）12（57.1）Low 29 12（41.4）17（58.6）0.011 1.000 Depth of invasion T1+T2 9 4（44.41）5（55.6）T3+T4 41 17（43.9）24（56.1）0.018 0.896 Lymph nodemetastasis Yes 40 13（37.5）27（62.5）No 10 8（80.0）2（20.0）4.147 0.042 Tumor stageⅠ～Ⅱ9 4（44.4）5（56.6）Ⅲ～Ⅳ41 17（43.9）24（56.1）0.044 0.716

2.5 胃癌组织中Pokemon与p14ARF蛋白表达的关系：胃癌组织中，Pokemon与p14ARF蛋白表达率呈明显负相关（r=-0.280，P=0.049），见表4。

表4 胃癌组织中Pokemon与p14ARF表达的相关性分析Table 4 Correlations between the exp ression of Pokemon and p14ARFin gastric carcinoma tissues

3 讨 论

Pokemon蛋白是由ZBTB7基因编码的具有584个氨基酸的蛋白质［4］，在多种组织中都有表达。Morrison等［5］通过Northern Blot分析发现Pokemon mRNA表达于人外周血白细胞、结肠、小肠和卵巢，同时通过Western Blot分析还发现所有人类细胞系（包括HeLa、Jurkat、BJAB和Raji细胞）都存在Pokemon蛋白的表达。Davies等［6］发现人和鼠Pokemon基因广泛表达于成熟组织和细胞系。乳腺癌T47D细胞系及成人皮肤组织中均存在Pokemon过表达［7］。本研究采用免疫组织化学法检测Pokemon蛋白表达率为78%，正常胃黏膜组织表达率为45%，提示胃癌组织中存在Pokemon蛋白过度表达。Lee等［8］研究表明，Pokemon的痘病毒锌指结构域可与核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）-p65的Rel同源结构域发生反应，这种分子间的反应能增加细胞核NF-κB的稳定性，使NF-κB更长时间维持于核内。而NF-κB的异常核内激活与恶性肿瘤的发生及转移密切相关［9］。淋巴结转移是胃癌转移的重要途径，亦是影响胃癌患者预后的重要因素。本研究发现有淋巴结转移组的胃癌组织中Pokemon蛋白表达率为87.5%，无淋巴结转移组的为40.0%，提示Pokemon过表达与胃癌淋巴结转移有密切关系。因此，推断Pokemon可能增加了细胞核内NF-κB的表达水平并维持其稳定性，使NF-κB作用其靶基因，从而通过相关机制促使胃癌发生淋巴结转移。

p14ARF功能失活可导致多种肿瘤发生［10］。胃癌组织p14ARF基因通常会发生变异，导致p14ARFmRNA及其蛋白无表达，从而加速细胞通过G1→S和G2→M调控点，使细胞呈无限制方式增殖生长，最终导致胃癌发生和发展［2］。本研究结果显示，胃癌组织p14ARF蛋白表达率为42%，正常胃黏膜组织为90%，证实p14ARF蛋白缺失是导致胃癌的发生的原因之一。本研究还发现，有淋巴结转移组的胃癌组织中p14ARF蛋白表达率为37.5%，无淋巴结转移组为80.0%。p14ARF蛋白表达率，随着分化程度的降低、浸润程度的加深和临床分期的升高而降低。这些可能与肿瘤抑制蛋白p14ARF参与了癌基因诱导的p53失活，过表达的癌基因能使p14ARF蛋白表达水平下调有关。

在肿瘤转化过程中，p14ARF和p53的失活与原癌基因的过表达有协同作用［11］。本研究发现在细胞核Pokemon蛋白高表达的39例胃癌中同时有27例细胞核p14ARF蛋白低表达；在细胞核Pokemon蛋白低表达的11例胃癌中同时有9例细胞核p14ARF蛋白高表达，显示胃癌组织中Pokemon蛋白表达与p14ARF蛋白表达呈明显负相关。已有研究［12］发现，在ARF激动剂中存在数个Pokemon结合位点及数个转录调节物，可以调控ARF激动剂，从转录水平抑制了ARF的产生，使细胞内抑制机制缺陷，细胞增殖失控，导致肿瘤发生。设想如果有外源分子能够拮抗或消除Pokemon的作用，则ARF可以发挥正常功能，从而消除癌变倾向。因此，能够抑制Pokemon的药物可能成为一种强有力的抗癌剂。（本文图见封二）

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（本文编辑：赵丽洁）

EXPRESSIONS OF PROTEIN POKEMON AND p14ARFIN GASTRIC CARCINOMA TISSUES AND THEIR SIGNIFICANCE IN CLINICAL BIOLOGICAL BEHAVIOUR

JIA Nan1，LIU Yueping2，LIYong1*
（1.The Third Department of Surgery，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China；
2.Department of Pathology，the Fourth Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050011，China）

ObjectiveTo explore the relationship of the clinical biological behaviour and the expressions of Pokemon protein and p14ARFprotein in gastric carcinoma tissues.MethodsThe expressions of Pokemon and p14ARFproteins in specimens resected from 50 gastric carcinoma tissues and 20 adjacent noncancerous gastric tissue were detected by immunohistochemicalmethod.The correlations between the expression of Pokemon and p14ARFand the clinical histopathologic characters were retrospectively analyzed，including patientsˊsex and age，tumor location and size，gross type，differentiation degree，infiltration depth，lymph nodemetastasis，and clinical stage，etc.ResultsThe expressions of both Pokemon protein and p14ARFwere located in cellular nucleus in gastric carcinoma and normal gastric mucosa which showed buffy granulation in positive staining cellular nucleus.The expression rates of Pokemon in gastric carcinoma and adjacent noncancerousgastric tissuewere 78%and 45%，respectively，in which the difference was statistically significant（P＜0.05）.The expression rates of p14ARFprotein ingastric carcinoma and adjacent noncancerous gastric tissue were 42%and 90%，respectively.The difference also was statistically significant（P＜0.05）.②Pokemon protein expression rates of gastric carcinoma tissue were 87.5%and 40%in the presence and absence of lymph nodemetastasis，which was significantly different（P＜0.05）；Pokemon protein expressions were increased with the increases in tumor size，depth of invasion，and clinical stage.③The expression rates of p14ARFprotein were 37.5% and 80%in gastric carcinoma tissues with and without lymph node metastasis，and the latter was significantly higher than the former（P＜0.05）.p14ARFprotein expressions were decreased with the decrease in the degree of tumor differentiation and increases in the depth of invasion and clinical stage.④There was a significant negative correlation between the positive nuclear Pokemon expression and the positive nuclear p14ARFexpression（P＜0.05）.ConclusionPokemon overexpression and p14ARFlow expression in gastric carcinoma tissues can indicate the extent of clinical biological behaviour，such as the carcinogenesis，development，invasion，and metastasis of gastric carcinoma.

stomach neoplasms；pokemon protein；tumor suppressor protein p14ARF

R735.2

A

1007-3205（2012）03-0263-05

2011-08-01；

2012-02-29

贾楠（1981-），男，河北石家庄人，河北医科大学第四医院医师，医学硕士，从事胃肠肿瘤诊治研究。

*通讯作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.03.006