崔 芳，乔 君，王 一，王 丽*

（1.河北医科大学电镜实验中心，河北石家庄 050017；2.河北医科大学第一医院精神科，河北石家庄 050031；3.河北医科大学第二医院超声科，河北石家庄 050000）

·技术方法·

制备肾脏扫描电镜样品的技术方法改良

崔 芳1，乔 君2，王 一3，王 丽1*

（1.河北医科大学电镜实验中心，河北石家庄 050017；2.河北医科大学第一医院精神科，河北石家庄 050031；3.河北医科大学第二医院超声科，河北石家庄 050000）

肾小球；显微镜检查，电子，扫描；研究技术

肾脏组织的超微结构研究主要集中在肾小球，通常使用透射电镜经过超薄切片观察细胞器的二维平面变化［1-3］。随着研究的深入，愈发需要满足不同的科研目的及特殊的临床要求。冷冻割断技术是一种可以观察组织细胞内部的扫描电镜（scanning electronmicroscope，SEM）制样技术，它充分显示了内部结构的三维立体形象，具有不可替代的地位，但因有取材要求高、操作流程长、设备装置多、成本价格高、伤害污染重等不足［4］，限制了广泛应用。而常规样品表面制备方法无法准确找到肾小球，即使从切割的部位找到肾小球，往往由于取材切割的挤压而使结构杂乱无章。为再现肾小球的三维形态，我们将常规制备SEM样品的技术方法进行改良，既能如冷冻割断一般，显示组织细胞内部的三维结构，又具有取材方便易行、操作简单轻松、样品易于保存、实验重复性高等特点，从而为肾脏及与之类似组织的超微结构研究提供新思路。现将此方法具体介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料：动物，雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠3只（河北省实验动物中心提供），2只成年大鼠体质量在300g左右，1只老年大鼠体质量500g。

1.2 方法

1.2.1 常规SEM样品制备：10%水合氯醛（0.5mL/100g）腹腔注射麻醉成年大鼠，取右侧卧位，腹膜后暴露分离出肾脏组织，预冷的双面刀片从肾脏皮质部位切取5mm×5mm×5mm的组织块，放于2.5%戊二醛固定液中固定4h。施以常规表面扫描样品制备法，乙醇梯度脱水；叔丁醇干燥；IB-3离子喷镀仪镀膜；日立S-3500N SEM观察。

1.2.2 改良SEM样品制备：动物麻醉成功后快速开胸暴露心脏，将输液针刺入左心室，同时剪开右心耳，经心-升主动脉先灌注37℃生理盐水200mL冲净血液，再灌注4℃含有2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的磷酸缓冲液（pH 7.4）400mL/只，最初10min快速灌注，后维持1h。后取材固定等操作同常规制样。

2 结 果

2.1 常规制样的观察：低倍镜下肾小球较清楚，能与周围的肾小囊及泌尿小管区别出来，但周围组织结构混乱，大量组织挤压、移位并覆盖在表面（图1）。高倍镜下可见足细胞胞体和胞体上依次伸出初、次级突起，偶见三级突起（图2），次级和三级突起朝向血管球基膜（glomrular basement membrane，GBM）的一侧呈膨大状，紧贴在GBM上，而胞体和初级突起则突向肾小囊腔，不直接贴附于GBM上，之间形成的间隙由邻近的突起伸入，但各级突起间相互连接交叉的关系不清楚（图3）；相邻次级突起或细胞自身的次级突起相互穿插镶嵌形成的栅栏状结构也发生改变，表现为突起的粗细不均，长短不谐，排列紊乱，突起间隙（即滤过裂隙）也模糊不清；其余结构无法辨认（图4）。

2.2 改良制样的观察：成年大鼠，低倍镜下肾小球与肾小囊分界清晰，周边是近端小管等泌尿小管的管腔断端（图5）。高倍镜下可清楚地看到饱满的足细胞，外形如蜘蛛样，攀附于毛细血管外周，胞体较大，表面清晰可辨散在的微绒毛（图6），其伸出的初级突起，进一步发出大量指状的次级突起，有的次级突起再分出少量三级突起（图7）；由初级突起垂直伸出系列平行的次级突起，后者又规律性的彼此镶嵌穿插，呈栅栏样排列整齐，走形分明，朝向GBM膨大的次级和三级突起，紧贴在GSM上，胞体、初级突起与GBM之间的间隙，由邻近的突起伸入填充，滤过裂隙也清晰可见（图8）；在肾小球毛细血管内皮细胞的腔面，可见典型的有孔型内皮（图9）；在肾小囊壁层为扁平多边形细胞，细胞核突向肾小囊腔，细胞表面有稀疏散在的微绒毛，各别有单根中央纤毛（图10）。

老年大鼠，低倍镜成像能清楚辨认出肾小球及周围小管的结构。高倍镜下可见肾小球足细胞胞体及初级突起皱缩、塌陷，有的足突上还有不明赘生物（图11）；有的次级突起及以下分支肿胀、融合，栅栏状结构排列紊乱，缺少突起贴附，暴露出GBM，滤过裂隙变窄（图12）。

图1 常规制样的低倍镜观察，示肾小球、肾小囊和泌尿小管，但周围组织结构混乱，大量组织残渣覆盖在表面（×1 500）图2 常规制样的高倍镜观察，示足细胞胞体，表面覆有组织残渣，影响观察（×6 000）图3 常规制样的高倍镜观察，足细胞胞体及其伸出的各级突起，但各级突起间相互连接交叉的关系不很清楚图4 常规制样的高倍镜观察，各级突起都粗细不均，长短不谐，排列紊乱（×18 000）图5 改良的成年大鼠低倍镜观察，肾小球与肾小囊分界清晰，周边是近端小管等泌尿小管的管腔断端（×1 000）图6 改良的成年大鼠高倍镜观察，示饱满的蜘蛛样足细胞，攀附于毛细血管外周，胞体表面有散在的微绒毛（↑示）（×5 000）图7 改良的成年大鼠高倍镜观察，足细胞胞体伸出初级、次级和三级突起（×10 000）图8 改良的成年大鼠高倍镜观察，栅栏状结构排列整齐，走形分明，滤过裂隙清晰（×20 000）图9 改良的成年大鼠高倍镜观察，示典型的有孔型毛细血管内皮细胞腔面（×20 000）图10 改良的成年大鼠高倍镜观察，扁平多边形的肾小囊壁层细胞，细胞核突向肾小囊腔，细胞表面有稀疏散在的微绒毛，各别有单根中央纤毛（↑示）（×3 000）图11 改良的老年大鼠高倍镜观察，足细胞胞体及初级突起皱缩、塌陷，各级突起上有不明赘生物（↑示）（×10 000）图12 改良的老年大鼠高倍镜观察，次级突起及以下分支肿胀、融合，栅栏状结构排列紊乱，缺少突起贴附，暴露出GBM（×10 000）

3 讨 论

通过上述对比观察可以看出常规SEM样品制备的肾脏组织，虽然能看到肾小球大体结构，但具体形态及与周围组织间的相互关系并不十分清晰，造成这一现象的主要原因在于样品切割取材后放入固定液，必然导致结构受挤及生活状态超微结构的改变。而经过技术改良的肾脏组织，先经心脏进行全身灌流固定，使其保持了良好的生活状态超微结构，所以在观察时可以非常清楚全面地辨别出肾小球、肾小管的形态及足突走向，甚至还可以观察到肾小球的有孔型毛细血管内皮细胞等结构，而这些结构在常规制样的肾脏中均未见到；在一些生理或病理情况下，如肥胖老年大鼠，肾小球足突发生的结构改变，也很清晰直观地表现出来，改变了以往只能用冷冻割断技术观察肾脏组织内部立体结构的观点［5］，为之提供新的思路；而且对于异地取材，技术改良使样品易于保存，不再受时间限制，加之制样时间缩短，操作简便，使SEM能以三维立体直观形象的成像视角更好地表现了不同于透射电镜的图像，为广大肾病研究者提供更有效的技术方法。扩展开来也可进一步广泛应用于其他与之类似的组织观察。

［1］ GARROSA M，LLANES F，GAYOSO MJ.Histopathological changes in gerbil liver and kidney after aluminum subchronic intoxication［J］.Histol Histopathol，2011，26（7）：883-892.

［2］ ZENG W，CHENG AC，CHEN ZL，et al.In vivo assessment of mitochondrial toxicity ofmetacavir in Rhesus monkeys after three months of intravenous administration［J］.Acta Pharmacol Sin，2009，30（12）：1666-1673.

［3］ YUAN LY，ZHANG HQ，XU DL.Protective effect of tongxinluo superflnes on anglotensinⅡcaused renal injury in rat［J］. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi，2009，29（12）：1104-1109.

［4］ 应国华.电镜技术与细胞超微结构［M］.香港：现代出版社，1993：59-79.

［5］ 叶达夫，张杰，姚颐.大鼠急、慢性梗阻性积水肾组织的形态学改变［J］.武汉大学学报：医学版，2010，31（2）：166-169.

（本文编辑：刘斯静）

R322-34

B

1007-3205（2012）03-0357-03

2011-10-13；

2011-11-01

崔芳（1980-），女，河北正定人，河北医科大学电镜实验中心助理实验师，从事电子显微学研究。

*通讯作者。E-mail：wl601021@yahoo.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.03.047