瑞香狼毒总黄酮提取物对肺癌细胞增殖及细胞周期的影响

2012-05-08贾春芳

河北医科大学学报 2012年3期

关键词：瑞香狼毒抑制率

段昕，贾春芳

（河北省张北县中医院内科，河北张北 076450）

·论著·

瑞香狼毒总黄酮提取物对肺癌细胞增殖及细胞周期的影响

段昕，贾春芳

（河北省张北县中医院内科，河北张北 076450）

目的研究瑞香狼毒总黄酮提取物对肺癌A549细胞的增殖抑制、细胞周期的影响。方法采用超声波技术提取瑞香狼毒根中的总黄酮。四甲基偶氮唑盐法检测总黄酮提取物对A549细胞的增殖抑制作用，流式细胞仪检测总黄酮提取物对A549细胞周期和凋亡的影响。结果瑞香狼毒总黄酮提取物呈明显的时间-剂量依赖性抑制A549细胞的增殖，即随着时间的延长、总黄酮提取物浓度的增加，抑制作用增强；总黄酮提取物可诱导A549细胞凋亡，并将A549细胞阻滞在G1期。结论瑞香狼毒总黄酮提取物具有抗肺癌的活性。

狼毒大戟；黄酮；肺肿瘤

肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一。在我国，肺癌的发病率和病死率均居各种恶性肿瘤的首位［1］。传统手术、药物等治疗方法仍是目前治疗肺癌的重要手段，但是由于其较强的不良反应，使得部分患者因为不能耐受而不得不中断治疗。近年来，中草药在治疗恶性肿瘤中表现出增效减毒作用而备受关注，为寻求防治肺癌及其他肿瘤性疾病开辟了一条新路。但中草药治疗疾病目前大多数仍停留在经验阶段，缺乏具体的药物成分、药效机制、安全性及不良反应等相关研究的验证［2］。本研究观察了不同浓度瑞香狼毒总黄酮提取物对肺癌A549细胞的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及药材：肺癌细胞株A549购自中科院细胞库；瑞香狼毒根购自东莞中草药公司。

1.1.2 试剂及药品：RPMI1640培养基购于北京欣兴唐生物科技有限公司；胰蛋白酶、核糖核酸酶-A、四甲基偶氮唑盐（3-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide，MTT）溶液和二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购自Sigma公司；胎牛血清购自Gibico公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：A549细胞培养于含6m L 10%小牛血清的RPMI1640培养基中，培养条件为37℃、5%CO2。每2～3d传代1次。

1.2.2 瑞香狼毒总黄酮提取：将瑞香狼毒根碾磨成粉，称取500g。采用无水乙醇浸泡过夜，超声波提取3次，每次30min，温度为55℃。取无水乙醇提取物加入石油醚30mL萃取，重复3次。再将提取液于旋转蒸发仪内减压浓缩。浓缩产物加蒸馏水50mL 60℃水浴2h后过滤，挥发。最后所得到的产物即为总黄酮提取液。-4℃保存备用。

1.2.3 MTT法检测细胞生长抑制：将对数生长的细胞以每孔200μL的浓度加入96孔培养板中，于37℃、5%CO2培养箱中培养48h后，离心去除上清液，实验孔分别加入终浓度为10、20、40、60、80mg/L的总黄酮提取物，每种浓度设5个复孔。另设空白组和对照组（不加总黄酮提取物，0mg/L）。24、48、72h后每孔加入MTT 20μL（5g/L），37℃孵育4h，弃上清，每孔加入DMSO 150μL，振摇30 min。用空白组调零，于酶标仪检测波长490 nm处每孔吸光度（absorbance，A）值求其平均值，计算细胞生长抑制率。以药物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标绘制生长曲线图。重复3次。细胞生长抑制率=（对照组A值-试验组A值）/对照组A值×100%。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡和周期：取对数生长期的细胞，调整细胞的初浓度至2×105个/mL加入7个培养瓶当中，加入不同浓度的总黄酮提取液，分别为终浓度为10、20、40、60、80mg/L，并另设空白组和对照组，共7组。48h后用胰蛋白酶消化收集细胞，1 200r/min离心5min收集细胞。24h后加预冷的0.5mL PBS液吹打混匀。将细胞吸起5mL至70%乙醇中24h后1 200r/min离心5min。收集细胞加入0.4m L PBS和6μL RNase-A，37℃水浴40min。加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）约50μL 4℃避光染色15min。用300目尼龙网过滤后流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期。以上实验重复3次。

1.3 统计学方法：应用SPSS15.0软件进行统计分析，计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞生长抑制实验结果：不同浓度的瑞香狼毒总黄酮提取物处理人肺癌细胞A549 24、48、72h后，用MTT法检测细胞的活性。结果显示，瑞香狼毒总黄酮提取物呈明显的时间-剂量依赖性抑制A549细胞的增殖。药物在低浓度时对A549细胞抑制作用不是很明显，但是随着提取物浓度的增加，抑制效果显著增强；在相同浓度药物的情况下，随着作用时间的延长，抑制率增大。采用80mg/L提取物作用A549细胞72h后，抑制率高达79.3%。见表1。

表1 不同浓度瑞香狼毒总黄酮提取物作用24、48及72h后对A549细胞的抑制率

2.2 细胞凋亡检测结果：采用不同浓度总黄酮提取物处理肺癌细胞A549 48h后，用流式细胞仪检测凋亡情况。总黄酮提取物10、20、40、60、80mg/L处理后的细胞凋亡率分别为（9.03±0.32）%、（10.48±0.41）%、（12.71±0.23）%、（16.09± 0.61）%、（30.99±1.56）%、（51.6±2.87）%，与对照组（6.98±0.32）%相比差异有统计学意义（P＜0.05），且各干预组两两比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 细胞周期检测结果：分析结果显示，A549细胞经不同浓度总黄酮提取物处理48h后，细胞G0/G1期细胞增多，S和G2/M期细胞减少。随着药物的浓度增加，G0/G1期细胞从（45.6±5.6）%（0mg/L）升高到（83.9±7.9）%（80mg/L）；S期细胞从（27.3 ±3.2）%（0mg/L）降低到（16.1±3.8）%（80mg/ L）；G2/M期细胞从（15.0±2.6）%（0mg/L）降低到（5.9±1.0）%（80mg/L）（图1）。这表明总黄酮提取物可使细胞阻滞于G1期。

3 讨论

瑞香狼毒是瑞香科狼毒属多年生草本有毒植物，为传统中药，性味苦平，具有杀菌、杀虫、散结等功效。国内研究显示瑞香狼毒具有一定的抗肺癌作用效果［3］。杨宝印［4］采用瑞香狼毒治疗恶性肿瘤54例，其中包括肺癌6例，治疗1个月以上有效率为63%，1年生存率达16%，显著高于对照组的4.6%（P＜0.05），提示瑞香狼毒具有抑制肿瘤细胞增殖的功效。陈伟等［5］同样发现用狼毒与鸡血藤、苡米、半枝莲等制成复方狼毒注射液可用于治疗晚期肺癌。但瑞香狼毒抗肿瘤的有效成分及其作用机制仍不清楚。

狼毒的主要成分包括香豆素类、黄酮类、二萜类、三萜类、木质素类等［6］。瑞香狼毒的有效成分对肺癌细胞或其他肿瘤细胞具有一定的抑制、促凋亡作用。樊俊杰等［7］分别观察了瑞香狼毒水和醇提取物对小鼠lewis肺癌细胞生长影响。瑞香狼毒水提物5～20g/kg对小鼠lewis肺癌生长抑制率为10.9%～40.6%；醇提物2.5～10g/kg对lewis肺癌生长抑制率为20.1～40.8%，且呈剂量反应关系。其他研究［8-9］同样发现瑞香狼毒水和醇提取物对肺癌细胞增殖、凋亡具有一定的效果。虽然采取了水或醇的提取，但提取物中的成分仍然十分的复杂。目前，越来越多的研究致力于探索瑞香狼毒的具体成分。如采用色谱法分离出的活性成分gnidimacrin具有较强的抗肿瘤活性，具有一定的临床应用价值。

目前，国内外尚未见采用超声波方法提取瑞香狼毒中总黄酮作用于肺癌细胞的研究报道。王敏等［10］观察了瑞香狼毒总黄酮提取物的抗人胃癌细胞SGC-7901、人肝癌细胞BEL-7402和人白血病细胞HL-60的效果。MTF法检测结果表明，瑞香狼毒总黄酮提取物与长春新碱对体外培养的人胃癌细胞SGC-7901和人肝癌细胞BEL-7402增殖都表现出较强的抑制作用，呈现较好的剂量依赖性抑制作用，且瑞香狼毒总黄酮提取物的急性毒性小。本研究首次观察超声波法提取瑞香狼毒总黄酮成分作用肺癌细胞A549。结果显示瑞香狼毒总黄酮提取物呈明显的时间-剂量依赖性抑制A549细胞的增殖，即随着时间的延长、总黄酮提取物浓度的增加，抑制作用增强，采用80mg/L提取物作用A549细胞72h后，抑制率高达79.3%。总黄酮提取物可诱导A549细胞凋亡，并将A549细胞阻滞在G1期。本研究初步结果显示瑞香狼毒总黄酮提取物具有抗肺癌细胞的活性，但瑞香狼毒总黄酮通过何种途径抑制肺癌细胞增殖、诱导凋亡等具体的作用机制，除了A549肺癌细胞株，对其他类型的肺癌细胞是否有同样的效果还有待于进一步的研究。

［1］陈万青，张思维，邹小农.中国肺癌发病死亡的估计和流行趋势研究［J］.中国肺癌杂志，2010，13（5）：488-492.

［2］刘新军，苏式兵.中药及其成分配伍组方的研究方法探析［J］.中西医结合学报，2009，7（7）：601-606.

［3］胡蓉蓉，王义善.瑞香狼毒抗肿瘤作用研究进展［J］.人民军医，2010，53（2）：151-152.

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［6］张慧文，鞠爱华，周秀娟.瑞香狼毒化学成分与生物活性研究进展［J］.中药材，2006，29（11）：1257-1261.

［7］樊俊杰，贾正平，谢景文，等.瑞香狼毒对小鼠移植肺瘤生长的影响［J］.兰州医学院学报，1994，20（4）：228-230.

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［10］王敏，贾正平，马骏，等.瑞香狼毒总黄酮提取物的抗肿瘤作用［J］.中国中药杂志，2005，30（8）：603-606.

（本文编辑：赵丽洁）

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